高通量定量比较细胞裂解液中未纯化融合酶比活性的方法及其应用

发布时间：2018-02-25 21:41

本文关键词： 高通量未纯化融合酶比活性最大吸附量测定　出处：《重庆医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：6-His标签与酶及其突变体融合表达后，可用ELISA原理或磁分离原理在固定亲和分离介质的量的基础上，通过预测亲和分离介质对融合酶的最大吸附量推算比活性等效量Vs，高通量定量比较酶及其突变体的比活性。该方法能够有效地克服克隆接种量、诱导表达效率、细胞裂解效率等的差异对裂解液中融合酶比活性的影响，尽量避免了假阳性突变体的出现。更关键的是，可以应用于定量测定细胞裂解液中的未纯化标签融合酶及其突变体的比活性，更有效的避开融合酶在纯化过程面临的技术、成本和劳动挑战，为酶突变体库的高通量筛选提供了快速、高效的方法。该方法建立需一个适合比活性的融合酶或突变体作为突变体设计的起始酶；一组适合的标签与亲和分离介质作为吸附分离实验的基础。本文首先建立定量测定细胞裂解液中未纯化融合酶及其突变体比活性的新方法。 1.高通量定量比较细胞裂解液中未纯化融合酶比活性方法的建立在测定室中的实验，利用的是亲和分离介质与细胞裂解液中的肽标签融合酶或其突变体所带标签的特异性结合。固定测定室中亲和分离介质的量，则每个测定室所能结合的最大蛋白量是与亲和分离介质对标签结合容量直接相关的数据。理论上，相同的亲和介质、相同的包被量，测定室中所能结合的肽标签量是相同即最大吸附量N，此时所测定出不同酶的活性Vs则是用来比较比活性最有价值的数据。当吸附结合量达到N时，即使不断增大测定室的蛋白量，反应速度V也不会再继续在增大，这时候测定室反应速度即是该酶的最大比活性（Vs）。但是，在实际操作中，要达到亲和介质吸附的饱和化，，除需要较大的蛋白量外，还会带来在活性测定中出现的反应速度过快的弊端。为解决这一点，通过跟踪吸附结合后的反应速度（V）与测定室中结合蛋白量--Quantity of Protein（μg）的响应曲线用双倒数法或是Matlab曲线拟合的方式来预测融合酶在测定室中的最大吸附容量（N）从而定量计算其比活性(Vs)。实验过程中根据ELISA原理与磁分离技术，我们可以同时对多个突变体的多个测定室进行实验操作，实现高通量模式下的比较。基于肽标签与亲和分离介质的可逆结合，建立对该可逆结合平衡的化学计量学新的分析方法。该方法不需要肽标签融合酶及其突变体的纯样品，其过程本身就是对加入测定室的样品的纯化、分离，最终测定的反应速度Vs即是纯酶的比活性，这为细胞裂解液中的未纯化融合酶活性的比较提供了一种新的行之有效的方法。 2.预测和定量比较6-His-羧酸酯酶及其突变体的比活性：mcAb为亲和分离介质通过基因全合成及突变体的构建得到一组融合6-His标签的羧酸酯酶及其突变体M326L，并以mcAb作为固定用亲和分离介质，利用ELISA原理，在高通量模式下对融合酶及其突变体进行诱导表达、蛋白浓度和表观比活性的测定，并应用本方法对融合酶及其突变体的细胞裂解液进行定量活性比较。通过双倒数曲线预测Vs得到Est1与M326L的相对比活性值为3.0±0.2，CV≤10%（n≥5），对比多批次诱导表达以及Matlab的正态性分析，得到二者的活性比值：在250ml与4ml培养基中分别为3.0±0.5，CV≥18%（n1=25，n2=11）和3.2±1.3，CV≥40%（n1=122,n2=35）。该应用中，抗体的用量为0.6μg即可满足要求，虽然其选择性较高，但亲和力不足，蛋白的用量甚至需要达到200μg以上，才能较准确的预测和比较，因此用于酶突变体库的的初筛收到样品量和成本的限制。当然，本方法样品为细胞裂解液上清，在准确性相对提高的同时，又使得比活性的测定不需要通过蛋白纯化这种复杂的过程，尤其适用于酶稳定性随温度、表面活性剂、金属离子等敏感改变的酶。即使同一酶的不同细胞裂解液由于其他因素导致的表观比活性差异可达到5倍以上时，只要在吸附分离过程中使得数据满足：Vmin≥0.090，Vmax≤1.800；最低稀释浓度点的抗体结合率在40%以上，本方法亦可有效预测Vs且CV值在10%以下，双倒数曲线的相关系数R2≥0.95。 3.预测和定量比较6His-大肠杆菌碱性磷酸酶及其突变体的比活性：Ni-NTA为亲和分离介质在以ECAP与R167K作为应用模型试验中，仍以6-His标签与酶及其突变体融合表达。ECAP与R167K用Ni-NTA纯化后获得较好的纯化效果，能相对准确得测得二者比活性的相对值为1.75±0.08CV≤5%(n=3)；采用本文建立的方法，用Matlab曲线拟合的方式预测Vs并得到ECAP与R167K的相对比活性值为1.73±0.14，CV≤10%(n=3)，R2≥95%，与纯化后所得标签融合酶及其突变体的比活性比值仅相差不到3%，比较通过多批次诱导表达得到二者的活性比值：在4ml培养基条件下为1.2±0.3，且CV≥20%（n1=n2=13）。进一步说明本方法在定量比较细胞裂解液中未纯化标签融合酶及其突变体的比活性方面的意义。该应用中使用亲和分离介质是Ni-NTA磁珠，我们可以根据酶比活性的高低，通过调整EP管中参与吸附分离反应的Ni-NTA磁珠的量以及酶促反应时间来控制反应速度。使用Ni-NTA磁珠量为25μg时，总蛋白上样量在1μg至20μg左右即可有效预测其在EP管中的最大吸附量（N），避免了杂蛋白对吸附分离的影响，当表达丰度P≥3%的时候，该方法便准确预测和测定酶的比活性Vs。当然要注意的一点就是：双倒数曲线应用的条件是测定室中融合酶或其突变体的总量n应是该测定室亲和分离介质的最大吸附量N的20倍或以上。由于在该应用中所使用的蛋白量很低，因此不满足双倒数法进行数据的分析的要求，取而代之的是Matlab的曲线拟合方法，仍是具有重要意义的。由于Ni-NTA磁珠的亲和力较mcAb高得多，但选择行却不及mcAb，故在实验操作过程中，蛋白质的用量更需要精心的控制。就整个操作而言，Ni-NTA磁珠的吸附分离反应更适用于突变体的确认，却不适合于突变体库的初筛。以Ni-NTA为亲和分离介质时整个实验操作过程仅为2h较mcAb的26h的耗时过程，大大降低实验耗时，即使对温度比较敏感的酶，也可得到较好地应用，因此更具有优势。该方法应用于突变体库的建立及高通量筛查中的关键是设计适合活性的肽标签融合酶作为突变体库建立的起始酶。根据酶活性的高低选择合适的亲和介质固定量、样品蛋白的稀释度、适宜的反应时间都显得极为重要。应用中能够有效地克服克隆接种量、诱导表达效率、细胞裂解效率等的差异对裂解液中肽标签融合酶比活性的影响，尽量避免了假阳性突变体的出现，并且能够在高通量模式下进行，为获得高活性突变体以及酶突变体库的建立与筛选提供了快速、高效、准确的方法。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

【参考文献】