肽核酸在杜兴肌肉萎缩症治疗中的应用研究

发布时间：2018-02-26 04:17

本文关键词： 杜兴肌肉萎缩症肽核酸抗肌萎缩蛋白外显子跳读反义寡核苷酸　出处：《天津医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：杜兴肌肉萎缩症(Duchenne Muscular Dystrophy-DMD)是一种X染色体连锁遗传的肌肉退行性遗传病,由抗肌萎缩蛋白dystrophin基因发生突变引起dystrophin蛋白缺失所致,目前临床尚无有效的治疗方法。反义寡核苷酸(Antisens Oligonucleotides,AOs)介导的外显子跳读在DMD的治疗研究方面显示出了巨大的潜力,已有两种反义寡核苷酸药物(2'Ome RNA和PMO)在III期临床试验。然而,最近2'Ome RNA临床试验未能达到预期的治疗效果;同样PMO也低于预期结果。因此,新型反义寡核苷酸药物的探索和研发对DMD疾病治疗具有非常重要的意义。肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)是一种新型、人工合成的化学结构,具有结构稳定、与核酸的结合力强、特异性高等特点。在前期工作中,我们已在DMD小鼠(mdx)模型上,通过局部肌肉注射,初步展示了PNA介导外显子跳读的潜力。在本研究中,我们通过优化不同长度PNA的生物活性,获得最佳候选长度PNA20作为系统测试的药物,并进一步对PNA20给药方案进行优化。结果显示:在高剂量重复给药条件下,PNA20能够高效地介导外显子跳读和dystrophin蛋白恢复表达,并能够部分恢复mdx小鼠的的肌肉功能;同时在系统测试中,未检测到任何药物相关的毒副作用,充分展示了PNA作为一种新型反义寡核苷酸候选药物,在DMD疾病外显子跳读疗法中的应用潜力。方法:1.不同长度PNA在mdx小鼠上的局部测试。设计不同长度的PNA并在杜兴肌肉萎缩症动物模型mdx小鼠上进行局部测试。在前胫骨肌(Tibialis anterior muscle,TA)上分别注射PNA20(+2-18)、PNA25(+7-18)、PNA26(+10-16)、PNA28(+7-21)和PNA30(+14-16),两周后收样,通过免疫组化分析、RT-PCR和Western blot方法检测不同长度PNA介导外显子23跳读效率及dystrophin蛋白恢复表达的水平。2.候选PNA在mdx小鼠上的系统测试。利用上步优化所得的候选PNA,系统测试PNA25和PNA30介导dystrophin基因外显子23跳读效率及蛋白恢复的能力。按照25mg/kg的剂量,以尾静脉注射的方法注射到mdx小鼠体内,每周注射1次,连续注射3次,注射结束四周后收集各部位肌肉组织样品,并通过免疫组化、RT-PCR等方法检测其诱导外显子23跳读效率和dystrophin蛋白的表达水平。3.酸性对PNA溶解性及活性影响的测试。用0.1M的Na OH调节PNA25的p H值分别为p H=2,3,4,5,6,7,用超微量核酸蛋白测定仪检测其浓度。将p H=5-6以及p H=2-3的PNA药物按照5μg/TA的剂量进行局部测试,注射完两周后收样。通过免疫组化检测dystrophin蛋白的恢复表达的水平。将p H1,p H=2-3,p H=4-5三组PNA药物按50mg/kg的剂量通过尾静脉的方法分别注到mdx小鼠体内,每周注射1次,连续注射3次。注射完四周后,收集全身肌肉组织样品,通过免疫组化及RT-PCR的方法检测其活性。4.优化不同长度PNA的系统活性。将PNA25和PNA20按50mg/kg的剂量分别通过尾静脉注射的方法注射到mdx小鼠体内,每周注射1次,连续注射3次。注射完四周后,收集全身肌肉组织样品,通过免疫组化、RT-PCR等检测其诱导外显子23跳读的效率和dystrophin蛋白的表达水平。本研究进一步比较了PNA20和PNA18在100mg/kg,连续注射3次的给药剂量下,二者诱导外显子23跳读效率及dystrophin蛋白恢复表达的情况。为进一步评估PNA20效力,本研究比较了PNA20和PMO在50mg/kg剂量下,连续3次注射,二者在mdx小鼠上介导外显子23跳读效率及dystrophin蛋白恢复表达的水平。5.高剂量PNA20系统活性测试。将PNA20分别按100mg/kg单次注射、3次连续注射和5次连续注射,每周1次的给药方案,通过尾静脉注射mdx小鼠,最后一次注射后四周,收集全身肌肉组织样品及肝、肾脏等组织,通过免疫组化、RT-PCR和Western blot等检测其诱导外显子23跳读的效率和dystrophin蛋白的表达水平。进一步对PNA20治疗mdx小鼠进行功能学评价,包括抓力测试(grip strength)、dystrophin蛋白相关蛋白复合体(DAPC)的恢复表达情况、血清肌酸激酶(CK)等指标。通过HE染色方法对治疗组mdx小鼠肝脏,肾脏进行病理学检测、通过检测血清中谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST)水平判断损伤情况、利用免疫组化法检测肌肉炎症细胞CD3、CD68分布情况,从而对PNA20系统毒副作用进行评估。结果:1.不同长度PNA在mdx小鼠局部优化测试结果显示:PNA20、PNA25和PNA30介导外显子跳读效率和dystrophin蛋白的表达水平较其他检测的PNA高,且差异显著,提示PNA20、PNA25和PNA30可以作为后续系统测试的候选药物。2.通过比较候选PNA25和PNA30系统注射后,mdx小鼠肌肉组织中dystrophin蛋白的表达水平,结果显示PNA30治疗组中阳性肌纤维数要略多于PNA25治疗组,但二者无显著性差异。同时,两个治疗组在心肌中均未检测到dystrophin阳性肌纤维表达。3.不同p H值条件下PNA的活性测试结果显示:PNA溶液在p H值为2-3时,PNA溶解度较高且活性最高,局部和系统测试结果均证明这一结果。4.PNA25和PNA20的系统活性测试结果显示:在同等剂量下,PNA20与PNA25在介导外显子跳读及恢复dystrophin蛋白表达的活性相当,但PNA20具有更高的安全性和溶解度,二者介导dystrophin蛋白表达和外显子跳读的整体水平均未达到治疗水平。进一步与PNA18在100mg/kg,连续3次注射的系统注射效果比较显示:提高剂量后,PNA20治疗组中dystrophin阳性肌纤维数量、外显子23跳读效率和dystrophin蛋白表达水平均高于PNA18治疗组,显示PNA20作为DMD候选药物的潜力。5.对PNA20系统、全面的活性及给药方案优化测试结果显示:PNA20表现出明显的剂量效应,在100mg/kg剂量下,5次重复注射治疗组dystrophin阳性肌纤维数、外显子23跳读效率和dystrophin蛋白表达水平与单次及三次重复注射相比,均表现出显著提高。在5次重复注射治疗组中,在股四头肌及腓肠肌中dystrophin蛋白表达水平接近40%正常水平。进一步功能测试结果表明:在5次重复给药后,治疗组mdx小鼠的各项功能指标显著改善,包括抓力水平显著提高、DAPC恢复正常定位、血清中CK值显著下降等,说明5次重复注射能够显著恢复mdx小鼠的功能。对PNA20在高剂量重复注射的条件下的毒性测试,未发现明显的药物相关毒副作用及免疫反应。结论:1.通过对不同长度PNA的局部活性优化,结果表明:PNA表现出明显的长度依赖型效应,即随PNA长度增加,其活性增加,其中PNA30活性最高,其次为PNA25和PNA20。2.在对不同长度PNA在mdx小鼠上的系统活性测试中,发现随PNA长度增加,其溶液酸性逐渐变强,PNA30PNA25PNA20。PNA溶液的酸性导致较长PNA不适合在mdx小鼠上的系统测试。其酸性来源于PNA纯化过程中的三氟乙酸。因此,尽管PNA30活性略优于PNA20和PNA25,但基于目前PNA的纯化工艺,PNA20为活性和安全性的最佳组合长度。同时,我们的研究发现:PNA在不同酸性条件下,其溶解度及生物活性差异较大;在p H值为2-3时,PNA的生物学活性最高。3.对PNA20给药方案的优化及系统测试研究,显示在剂量为100mg/kg,多次重复给药的条件下,PNA20能够有效地介导外显子跳读和诱导dystrophin蛋白恢复表达。在100 mg/kg剂量,5次重复注射,能够诱导约40%正常水平的dystrophin蛋白表达,并有效地恢复治疗组mdx小鼠的肌肉功能。尤为重要的是,相关药物毒性测试结果显示:在高剂量重复给药的条件下,未检测到任何毒性及免疫反应发生,提示PNA20是安全有效的候选药物,为DMD疾病的临床治疗提供了一种有效的候选药物。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96

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