9型腺相关病毒介导CaMEK基因增强小鼠肥厚心肌缺血后适应保护作用的机制研究

发布时间：2018-02-27 18:04

  本文关键词： 肥厚心肌 缺血后适应 基因 心肌缺血再灌注损伤 主动脉弓缩窄 重组9型腺相关病毒　出处：《新疆医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：本研究旨在通过观察主动脉弓缩窄（TAC）后压力诱导的小鼠肥厚心肌和正常心肌缺血后适应对心肌保护作用及RISK信号通路表达的差异，探讨肥厚心肌小鼠缺血再灌注损伤的分子生物学机制。并进一步以携带CaMEK基因的重组9型腺相关病毒（rAAV9），靶向性增强小鼠肥厚心肌RISK信号通路表达以达到增强肥厚心肌缺血后适应对心脏的保护作用。本研究包括：⑴建立小鼠肥厚心肌模型，研究小鼠正常心肌和肥厚心肌缺血后适应对心肌保护作用及ERK1/2信号通路、PI3K-Akt信号通路表达的差异。⑵探讨rAAV9-eGFP对小鼠正常心肌和肥厚心肌转染的有效性和安全性。⑶应用rAAV9-CaMEK基因靶向性增强小鼠肥厚心肌ERK1/2信号通路，观察缺血后适应能否有效减少小鼠肥厚心肌的缺血再灌注损伤。方法：课题第一部分：近交系C57BL/6（10周龄）雄性小鼠110只，按1:1比例随机分为TAC组和假手术组（Sham），⑴选取两组小鼠各20只观察术后0w，1w，3w，5w经胸超声心动图、组织重量和心肌病理学检测。其余两组小鼠各35只，术后5w采用Langendorff离体心脏灌流装置建立缺血再灌注（I/R）和缺血后适应（IPostC）模型，测定离体心脏血液动力学，采用氯化三苯四氮唑（TTC）染色确定心肌梗死面积和终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位末端缺口标记法（TUNEL）计算心肌凋亡细胞。⑵应用Western Blot法检测两组术后5w ERK1/2、Akt、P70S6K、GSK-3β总蛋白及磷酸化蛋白表达水平。课题第二部分：116只C57BL/6（10周龄）小鼠按1:1比例随机分为TAC组和Sham组，5w后TAC组再随机分为7个病毒亚组，每组6只。Sham组再随机分为4个对照亚组，每组4只。病毒亚组经尾静脉注射携带有增强型绿色荧光蛋白的rAAV9（rAAV9-eGFP），对照亚组注射同等剂量的生理盐水。随机各取4组于0d、21d、35d、60d测定经胸超声心动图和血液生化指标，病毒亚组并于0d、7d、14d、21d、28d、35d、60d使用荧光显微镜观察eGFP在心、肝、肺、肾、脑、骨骼肌的荧光表达，同时Western Blot法检测eGFP的蛋白表达。课题第三部分：⑴24只C57BL/6（10周龄）小鼠按1:1:1:1比例随机分为Sham组，TAC组，TAC-eGFP组和TAC-CaMEK组，分别经尾静脉注射生理盐水，生理盐水，rAAV9-eGFP和rAAV9-CaMEK。于1w后第1组行Sham，余3组分别行TAC。术后5w采用WesternBlot法和逆转录多聚酶链反应法（rt-PCR）检测心肌组织MEK表达。⑵另选40只小鼠按1:1随机分组，术前1w经尾静脉分别注射rAAV9-eGFP和rAAV9-CaMEK，术后5w采用Langendorff离体心脏灌流装置建立I/R和IPostC模型，，TTC染色的方法确定心肌梗死面积，TUNEL法计算心肌凋亡细胞。⑶另选30只小鼠术前1w经尾静脉注射rAAV9-CaMEK，后行TAC。术后0w，1w，3w，5w经胸超声心动图检查，术后5w随机选择5只小鼠测定血液生化指标和组织重量，其余25只采用Langendorff离体心脏灌流装置建立I/R和IPostC模型，测定离体心脏血液动力学，应用WesternBlot法检测ERK1/2、Akt、P70S6K、GSK-3β总蛋白及磷酸化蛋白表达水平。结果：课题第一部分：⑴超声显示TAC组Awsth、Awdth、Pwsth、Pwdth、LVEDD在术后3w、5w与同时间点Sham组比较均显著增加（P＜0.05），TAC组Awsth、Pwsth、Pwdth术后5w相比术后3w均显著增加（P＜0.05）；TAC组HW、LVW、LVW/BW、HW/TL、LVW/TL在术后3w、5w与同时间点Sham组比较均显著增加（P＜0.05），TAC组HW、LVW、LVW/BW、HW/TL、LVW/TL术后5w相比术后3w时间点均显著增加（P＜0.05）；HE染色TAC组3w、5w后表现为心肌细胞明显肥大；TAC组IPostC与IR比较，LVSP、LVDP、dp/dtmax、dp/dtmin均无统计学差异；TAC组IPostC后心肌梗死面积与I/R组比较无统计学差异[（46.47±6.14）%Vs （50.26±9.41）%，P＞0.05]，同时显著高于Sham组IPostC[（46.47±6.14）%Vs （31.62±5.32）%，P＜0.05]。TAC组IPostC后TUNEL阳性细胞与I/R比较无统计学差异[（41±1.6）%Vs（44±2.8%），P＞0.05]，同时显著高于Sham组IPostC[（41±1.6）%Vs （12±1.6%），P＜0.05]。⑵Western Blot法提示Sham组IPostC处置后ERK1/2和P70S6K磷酸化蛋白水平较I/R比较显著增强（P＜0.05），TAC组IPostC处置较I/R比较无统计学差异（P＞0.05），两组Akt和GSK-3β磷酸化蛋白水平无明显变化。课题第二部分：经尾静脉注射rAAV9-eGFP后，在荧光显微镜下观察心肌组织冰冻切片，eGFP在正常心肌和肥厚心肌7d起表达，35d转染效率均达到高峰，转染效率分别为42%和46%，观察至60d持续高峰表达。eGFP具有心和肝的靶向性。Western Blot法eGFP蛋白表达与上述趋势一致。观察期内与未注射rAAV9-eGFP组比较超声心动图、血液生化指标均无统计学差异。课题第三部分：⑴通过Western Blot法和rt-PCR法检测心肌细胞MEK表达，rAAV9-CaMEK组较Sham组，TAC组，TAC-eGFP组显著增高（P＜0.05）。⑵rAAV9-CaMEK组IPostC后心肌梗死面积显著低于I/R[（34.05±5.73）%Vs （42.73±7.38）%，P＜0.05]，同时显著低于TAC-eGFP组IPostC（[34.05±5.73）%Vs （51.34±6.90）%，P＜0.05]。TAC-CaMEK组IPostC后TUNEL阳性细胞显著低于I/R [（14±3.0）%Vs （36±1.6%），P＞0.05]，同时显著低于TAC-eGFP组IPostC [（14±3.0）%Vs （44±1.5）%，P＜0.05]。⑶TAC-CaMEK组超声心动图检测术后3w、5w的Awsth、Awdth、Pwsth、Pwdth、LVEDD与术前比较均明显增加（P＜0.05），术后5w的Awsth、Pwsth、Pwdth与术后3w比较均明显增加（P＜0.05）；血液生化指标与相关参考值比较未见显著差异；HW、LVW、LVW/BW、HW/TL、LVW/TL在术后5w与同时间点Sham组比较均显著增加（P＜0.05）。与同时间点TAC比较无显著差异（P＞0.05）；IPostC组与IR组比较，LVSP、LVDP、dp/dtmax、dp/dtmin、dp/dtmin均显著升高（P＜0.05）；Western Blot法提示rAAV9-CaMEK组IPostC处置后ERK1/2和P70S6K磷酸化蛋白水平较I/R比较显著增强（P＜0.05），且ERK1/2和P70S6K磷酸化蛋白水平可以达到SH组IPostC水平（P＞0.05），Akt和GSK-3β磷酸化蛋白水平无明显变化。结论：⑴通过建立小鼠TAC模型诱导心肌肥厚发现，3w后心肌即可出现稳定性肥厚，且5w内呈一稳定的病理生理改变，心功能未见异常。通过TAC5w后成功建立的小鼠LVH模型，进行离体心脏缺血再灌注模型发现小鼠肥厚心肌的IPostC保护作用较正常心肌明显减弱，表现在心功能减退、心肌梗死面积增大和心肌凋亡细胞显著增多。肥厚心肌ERK1/2-P70S6K信号通路不能被有效的激活是造成上述原因的关键。⑵经尾静脉注射rAAV9-eGFP报告基因，发现正常心肌和肥厚心肌35d转染效率均达到高峰，60d持续表达。具有心和肝的靶向性。观察期内对肝肾功能无影响。⑶经尾静脉导入rAAV9-CaMEK基因，通过Western Blot和rt-PCR方法观察5w可有效地转导入心肌细胞，靶向性激活MEK，结果显示IPostC可以有效激活肥厚心肌的ERK1/2-P70S6K信号通路磷酸化表达，从而改善其心功能，减少心肌梗死面积和心肌凋亡细胞，达到了类似正常心肌IPostC的保护作用。观察期内rAAV9-CaMEK对心功能和肝肾功能均无影响。
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【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R965


本文编号：1543739