阿托伐他汀对Aβ寡聚物引起大鼠海马神经损伤的保护作用及机制的研究

发布时间：2018-03-09 21:03

本文选题：阿尔茨海默病　切入点：阿托伐他汀　出处：《辽宁医学院》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的我们前期研究表明，阿托伐他汀(atorvastatin，Ato)对培养神经元突触相关蛋白和树突生长发育有促进作用，阿托伐他汀也能够对-淀粉样蛋白1-42(A1-42)引起的神经元突触损伤具有保护作用，但作用机制不清楚。本研究进一步观察阿托伐他汀对Aβ1-42寡聚物(AβOs)引起的神经元损伤是否具有保护作用并探讨其信号转导通路。方法 AD大鼠模型的建立，SD大鼠40只，随机分为4组，每组10只即正常对照组、Aβ1-42损伤组、Ato+Aβ1-42组、单独Ato组。连续用Ato灌胃3周后，Aβ1-42损伤组和Ato+Aβ1-42组脑室内恒速注射Aβ1-42寡聚物(1mmol·L-1)5μl，正常对照组、单独Ato组脑室内恒速注射等量生理盐水。脑室注射24h后进行大鼠Morris水迷宫实验观察大鼠学习记忆功能，大鼠连续训练8d，第9d进行空间探索实验，实验期间继续给药。Morris水迷宫实验结束后，动物麻醉状态下，生理盐水灌流后断头取脑，快速分离海马组织，-80℃冻存备用。Western blot印迹法检测大鼠海马组织内突触素（SYP）、突触后致密蛋白95（PSD-95）、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38MAPK）蛋白表达量；应用ELISA试剂盒检测大鼠海马组织炎症因子白介素1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含的改变。大鼠脑微透析实验分组，40只SD大鼠，随机分为五组：生理盐水对照组、A1-42损伤组、单独Ato组、Ato+A1-42治疗组、Ato灌胃+A1-42治疗组，每组8只。10%水合氯醛腹腔(0.3mL·l00g-1)麻醉后，分别于左侧脑室和右侧海马植入透析套管，牙科水泥外固定。24h后，大鼠在清醒状态下进行脑微透析实验，每30min收集1管透析液。取前3管透析液作为基础值。生理盐水组大鼠脑室恒速注射5μL生理盐水；损伤组大鼠恒速注射A1-42(1mmol·L-1)5μL；单独Ato组注射Ato (2.5μg·μl-1)3μl；Ato+A1-42治疗组先注射Ato3μl，30min后再注射A1-42(1mmol·L-1)5μL；Ato灌胃+A1-42治疗组，Ato灌胃两周后植入透析套管，左侧脑室恒速注射A1-42(1mmol·L-1)5μL，每次透析前Ato灌胃；连续收集透析液至96h后。收集透析液随即应用高效液相色谱-电化学检测法(HPLC-ECD)测定所收集透析液中去甲肾上腺素（NE)，肾上腺素（EP），五羟色胺（5-HT），5-羟吲哚乙酸（5-HIAA)的含量。体外培养海马神经元，取0~24h的SD大鼠乳鼠，无菌条件剥离大脑分离海马组织，剪碎-消化后置于DMEM/F12培养基中37C、5%CO2培养箱中培养7d后用于实验，细胞实验分组：正常对照组；A1-42(20、50、100nmol·L-1)处理组；A1-42+Ato (1、2.5、5) μmol L-1组。正常对照组，培养7d神经元加入0.1%的DMSO作用48h；A1-42处理组：培养7d神经元加入50nmol·L-1的A1-42作用48h；A1-42+Ato组：培养7d神经元加入Ato作用1h，再加入A1-4250nmol·L-1的共同作用48h。应用倒置相差显微镜观察海马神经元的形态改变，免疫荧光染色观察微管相关蛋白-2(MAP-2)、SYP表达的改变，Westernblot印记法检测SYP、PSD-95、 p-p38MAPK蛋白表达水平。结果应用考马斯亮蓝染色和Western Blot印迹法分析显示本研究应用的AβOs主要由Aβ二聚体(约8kDa)和Aβ单聚体组成。我们应用ELISA方法测定了脑室内注射AβOs后24h和9d海马内Aβ含量，结果显示，脑室内注射Aβ后能导致海马内Aβ量较注射生理盐水组明显升高，证明了脑室内注射的Aβ能到达海马。 Morris水迷宫实验结果显示，AβOs损伤组大鼠找到平台所需时间较生理盐水对照组明显延长，大鼠在原平台象限游泳时间占总游泳时间的百分比及穿越平台次数均明显低于生理盐水对照组， Ato+Aβ1-42组大鼠找到平台所需时间明显短于AβOs损伤组，在原平台象限百分比及穿越平台次数明显高于AβOs损伤组。Western Blot印迹法检测大鼠海马和体外培养海马神经元SYP和PSD-95蛋白表达结果显示，脑室内注射AβOs后9d，海马SYP和PSD-95蛋白表达较生理盐水对照组明显降低。应用培养海马神经元模型也显示AβOs能剂量依赖性的降低SYP和PSD-95蛋白表达水平，Ato能明显对抗AβOs引起的大鼠海马和体外培养海马神经元的SYP和PSD-95蛋白表达水平的降低，进一步证明了Ato对Aβ引起的突触损伤有明显的保护作用。应用ELISA试剂盒检测IL-1β、TNF-α、IL-6的含量，结果表明脑室内注射AβOs后能使大鼠海马IL-1β、TNF-α、IL-6含量较生理盐水对照组明显增加，Ato能明显抑制AβOs引起的这些细胞因子的增加。为了探讨Ato产生神经保护作用的信号转导机制，我们观察了海马和培养海马神经元p-p38MAPK表达的改变，结果显示脑室内注射AβOs使海马p-p38MAPK蛋白表达水平较对照组明显增加，，应用AβOs处理培养海马神经元，也能使p-p38MAPK蛋白表达水平明显增加，Ato处理能明显对抗AβOs引起的p-p38MAPK蛋白表达水平的增加。应用p38MAPK特异性阻断剂SB203580也能抑制AβOs引起的体外培养海马神经元的SYP和PSD-95蛋白表达水平的降低，说明AβOs引起的突触损伤与p38MAPK信号通路上调有关。 SD大鼠脑微透析实验结果显示，侧脑室内注射AβOs组大鼠给药后24h和48h后海马内NE、EP含量明显增加，但给药后72h和96h后NE的含量明显下降，而EP的含量持续上升。在注射AβOs前脑室注射阿托伐他汀能对抗AβOs引起的NE的改变，也能部分对抗AβOs引起的EP含量的增加。此外，脑室内注射AβOs48h能引起海马5-HT和5-HIAA的水平明显降低，其作用一直持续到注射后96h，在注射AβOs前脑室注射阿托伐他汀能对抗AβOs引起的5-HT和5-HIAA水平的降低。灌胃给予阿托伐他汀产生的作用与侧脑室注射给药作用相似。结论 1、阿托伐他汀可以明显改善AβOs引起的大鼠空间学习记忆障碍； 2、阿托伐他汀对抗AβOs引起的大鼠空间学习记忆损伤与对抗AβOs引起的突触损伤有关； 3、阿托伐他汀能对抗AβOs引起的海马单胺类递质释放的改变； 4、阿托伐他汀产生的神经保护作用可能与抑制p-p38MAPK信号转导通路，进而抑制AβOs引起的炎症反应有关。
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【学位授予单位】：辽宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R966

【参考文献】