表面修饰的金纳米颗粒携带血管内皮生长因子透皮转运研究

发布时间：2018-03-16 02:16

  本文选题：金纳米颗粒　切入点：血管内皮生长因子　出处：《第三军医大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景和目的表面透皮给药系统(Transdemal drug delivery systems TDDS),是指直接在皮肤表面通过涂抹覆盖的方式给药,使药物通过皮肤吸收进入皮下,产生全身或局部治疗作用的一种新型药物输送途径,属于无创伤性给药方式。透皮给药作为一类特殊的给药途径,与传统的给药方式(口服和注射)相比,其优势明显:1、可以避免药物在胃酸条件下水解失活,减少与消化酶接触的机会;2、可避免肝脏的首过效应,从而达到更好的药物效应,并减少用药个体差异;3、可以随时撤销用药。如何治疗由烧伤或辐射造成皮肤损伤在临床上仍是一个棘手的问题。皮肤大面积深度坏损,无法愈合,需要通过植皮以修复创面。但由于皮下血管的毁坏,植皮后的创面得不到充足的血液供应而难以愈合。因此恢复病灶区域的血液供应是修复受损皮肤的必要条件。血管内皮生长因子(VEGF)由于其特有的高效促血管生成作用,诱导触发新的血管的内皮细胞生成,新生血管能恢复皮肤局部血供,提供表皮和真皮细胞再生所需营养物质,从而促进皮肤损伤修复,恢复屏障功能。然而,传统给药的方法不能使VEGF准确有效地到达表皮和真皮,且维持其蛋白结构,保持原有生物活性。将VEGF通过透皮给药方式,穿过皮肤的屏障,到达皮下促进血管生成,可能成为有效的治疗皮肤损伤的方法。最近,纳米粒子(NPs)介导的透皮载药技术引起了大量的关注。其中金纳米颗粒作为药物载体,可以改变膜的转运机制,增加药物的细胞膜渗透性,药物经皮吸收后能在细胞内发挥其生物学效应。在本文中,我们合成了具有不同表面电荷的金纳米颗粒,评估它们的透皮效率,发现表面带负电荷的金纳米颗粒具有高效的透皮效率。VEGF通过生物链接金纳米颗粒后,其连接合成产物表面仍带负电荷。VEGF连接金纳米颗粒后,金纳米颗粒作为药物载体可以促使VEGF透过皮肤屏障,进入皮下,并维持其生物活性,诱导血管生成。我们的研究结果可以为皮肤损伤治疗提供新的方向。方法1.AuNPs合成方法及AuNPs的表面修饰利用柠檬酸缓冲体系还原制备AuNPs,之后加入SH-PEG-COOH,SH-PEG-NH2和PEG-SH三种不同的聚乙二醇修饰剂,获得表面有不同官能团的金纳米颗粒(citrateAuNP,AuNP-PEG-OCH3,AuNP-PEG-COOH和AuNP-PEG-NH2)。2.在体实验研究AuNPs的透皮效果选用Balb/c小鼠(雌,6~7周),背部剃毛处理,建立动物模型。将300μL的不同表面修饰的纳米金颗粒(citrate-AuNP、AuNP-PEG-OCH_3、AuNP-PEG-COOH、AuNPPEG-NH_2)溶液(2×10~(10)/mL,1.44μM)滴加在纱布上,覆盖脱毛处理后裸露的皮肤24 h。然后取皮,制片,用于TEM观察和银染处理后观察。3.MTT试验选择Balb/c3T3细胞评估AuNP-PEG-COOH的细胞毒性。4.AuNP-PEG-COOH与VEGF的连接AuNP-PEG-COOH调整浓度为2×10~(11)/mL,利用EDC/sulfo-NHS试剂将VEGF(连接了His标签,浓度为20μg/mL)与AuNP-PEG-COOH连接,得到合成产物AuNPCONH-VEGF。5.在体实验研究AuNP-CONH-VEGF的透皮效果运用上述动物模型,在无菌纱布上滴加300μL的AuNP-CONH-VEGF悬浮液,覆盖裸露皮肤24 h。24 h后,取皮制片,免疫组织化学染色法检测VEGF是否透过皮肤屏障进入皮下。同样动物模型,透皮处理7天之后,取皮制片,用免疫组化染色和HE染色,进一步研究透皮后的VEGF能否促进皮下血管生成。结果1.柠檬酸钠还原法合成的AuNPs,AuNPs的直径约11.2±0.1 nm,为几何学球形且呈分散性。修饰后的金纳米颗粒,AuNP-PEG-OCH_3(表面电中性),AuNP-PEG-COOH(表面带负电荷),AuNP-PEG-NH_2(表面带正电荷)。2.不同表面修饰的AuNPs透皮处理后,在皮肤表皮层真皮层均均发现纳米金颗粒。TEM图片只能定性地证明表面带不同电荷的AuNPs可以透过皮肤屏障进入皮下。我们将相同实验方法下得到的皮肤样本进行sliver-enhanced染色,以对表面带不同电荷的AuNPs的透皮效率进行探讨。统计结果显示,表面带负电荷的AuNPs,即AuNP-PEG-COOH组银染图片内的银染颗粒多于其他组。3.在10μM~50μM的浓度范围内AuNPs安全等级是1,具有较低的细胞毒性。4.AuNPs与VEGF结合后(AuNP-CONH-VEGF),表面电荷仍然是负电荷。5.我们在透皮处理24 h后的小鼠皮肤中,通过免疫组化染色,检测到了VEGF,而对照组未检测出。7天后,运用免疫组化染色和HE染色,分析统计血管生成情况,发现皮肤表面施用AuNP-CONH-VEGF,即实验组,皮下的血管密度明显高于对照组.结论1.表面带负电荷的AuNPs,即AuNP-PEG-COOH,具有最高透皮效率。2.连接了VEGF后的纳米金颗粒(AuNP-CONH-VEGF)的表面依旧带负电荷。3.使用EDC/sulfo-NHS将AuNP-PEG-COOH与VEGF连接,连接后的VEGF可以直接透过皮肤屏障,进入皮下,诱导血管生成。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R943;TB383.1

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