大鼠跟腱异位骨化模型及非甾体类药物预防效果实验研究

发布时间：2018-03-21 07:33

本文选题：异位骨化　切入点：大鼠　出处：《南方医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景异位骨化(Heterotopic ossification, HO)是一种软组织内异常的新骨形成,可以导致受累关节功能丧失。它与高钙血症引起的转移性钙化以及营养不良性钙化不同,因为HO形成的是成熟的板层骨结构。目前HO主要有三种类型：创伤性HO、神经源性HO、以及遗传相关性HO。创伤性HO在临床上最为常见,主要由髋臼骨折、肘膝肩关节的骨折、骨折脱位、以及爆炸和烧伤等损伤性刺激引发。创伤性HO是骨科相对棘手的问题,术后患者常见出现疼痛,关节活动度下降等临床表现,骨化甚至会导致关节活动丧失,严重影响到患者生活质量。但是对于HO确切发病机制仍然不明,因此没有很好的办法对其进行防控。HO形成的病理生理过程与生理状态下骨折愈合的生理过程类似。目前研究表明HO的病理生理进程中需要三种必备条件：成骨前体细胞、刺激诱导因素、持续的成骨环境。目前多数学者认为HO起源于软组织内的多潜能干细胞,主要是间充质干细胞,在刺激因素的作用下,局部成骨因子分泌,并且在适宜的成骨环境下,逐渐向成骨细胞分化,最终在组织内形成新生骨。目前研究较多的HO相关成骨因子主要有转化生长因子(Transforming growth factor-β, TGF-β)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)、前列腺素(prostaglandin, PG)、碱性成纤维生长因子(Basic f ibroblast growth factor, bFGF)、胰岛素样生长因长(Insulin-like growth factor, IGF)等。1944年Pederson发现一种血浆糖蛋白Fetuin-A,属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族,与钙有很强的亲和性,和生物矿化关系密切。Fetuin-A主要在肝脏合成,在血液中浓度很高,在骨和牙齿等部位聚集。在血液循环中它可以结合钙形成可溶性的钙-胎球蛋白颗粒,维持矿物离子的稳定,防止其聚积,是体内最强大的抑制矿化的蛋白质。Fetuin-A还对TGF-β和BMPs有拮抗作用,可阻断TGF-β与其细胞表面上的受体Tβ RⅡ结合。在成骨过程中需要大量钙,这种蛋白可能与HO的发生存在一定的相关性,对于HO的防治也可能产生一定的作用,但是目前Fetuin-A与HO的关系目前国内外相关报道很少,也没有相关的HO实验研究探索其在HO过程中血清以及局部异位骨组织中含量的变化。对于HO的预防,临床上尚无确切有效的方法,最为常用治疗为非甾体类药物(NSAIDs)和放射治疗。而NSAIDs治疗成本低,便于管理用药,目前仍被广泛应用。NSAIDs治疗能有效预防HO的发生,但是也存在一些弊端,长期服用会产生产生胃肠道不良反应,出现胃炎、胃溃疡,严重者会发生消化道出血。有骨折的患者若服用会增加骨折不愈合的风险。如何合理使用NSAIDs防治HO的发生,是目前需要解决的难题。临床上预防HO常用的NSAIDs有两类：非选择性COX2抑制剂(吲哚美辛)和选择性COX2抑制剂(塞来昔布)。然而高选择性的COX2抑制剂是否能更好的预防异位骨化的发生,目前仍不明了。为了验证跟腱切断HO模型的实用性,以及探究Fetuin-A与HO的关系,我们建立了大鼠HO模型,在HO不同阶段检测Fetuin-A在血清及异位骨组织中的变化。另外我们利用大鼠HO模型,比较研究了非选择性COX2抑制剂(吲哚美辛)和选择性COX2抑制剂(塞来昔布)在预防大鼠跟腱切断后HO的效果。本文分两章阐述如下：第一章异位骨化大鼠模型的建立及相关蛋白表达研究目的大鼠跟腱切断HO模型是近年来运用较多的HO模型,适用于创伤性HO的相关研究。Fetuin-A则是一种钙结合蛋白,在血循环及组织局部均发挥着抑制矿化的作用。本章实验复制了大鼠跟腱切断HO模型,以评估该模型的实用性,并且对Fetuin-A与HO形成的关系进行探讨。方法选取24只雄性Sprague-Dawley大鼠,6-8周龄,体重185.0±10.5g,随机分成2组(假手术对照组和HO模型组,n=12),在无菌条件下,对照组大鼠仅切开皮肤,模型组大鼠切开皮肤后钳夹并切断大鼠右侧跟腱造成HO模型。于造模后5,10周对所有大鼠右下肢行X线片摄片,观察异位骨化发生情况。在影像学评估后,第5、10周两组分别取6只大鼠,处死后取右侧跟腱行病理切片,分别行HE染色,Masson染色,并进行免疫组织学检查评估COX2、BMP2和Fetuin-A在跟腱局部的表达水平。分别于手术操作前随机选取6只大鼠,术后5周和10周两组大鼠分别选取6只,麻醉后断尾法取血1m1,采用ELISA定量检测试剂盒测定血清中Fetuin-A和BALP的含量。结果所有大鼠均存活至实验结束。术后5周,对照组大鼠均未出现骨化影,模型组大鼠11只(11/12)出现骨化影；10周时,对照组大鼠均未出现骨化影,模型组大鼠6只(6/6)均出现骨化影。术后5、10周,对照组大鼠跟腱呈白色,表面光滑,质地韧,弹性较好；而模型组大鼠跟腱呈灰白色,表面粗糙,体积较对照组跟腱粗大,质地更硬,弹性更差。第5、10周经影像学评估后取跟腱组织行病理学HE染色,Masson染色,证实了异位骨组织存在。病理检查结果显示,对照组均未出现H0,模型组12只均出现HO。免疫组织学检查：在第5、10周,COX2、BMP2、和Fetuin-A在对照组大鼠跟腱局部的表达水平组呈现阴性或者弱阳性。在第5周,COX2、BMP2、和Fetuin-A在模型组大鼠可见阳性表达。在第10周,COX2、BMP2、和Fetuin-A在模型组大鼠可见更强的阳性表达。血清ELISA检测：对照组血清Fetuin-A和BALP含量术前,第5、10周,三个时间点之间差异均无统计学意义(P0.05)；模型组5周和10周两个时间点,血清Fetuin-A含量均较术前明显降低,且均低于对照组血清Fetuin-A含量(P0.05),血清BALP含量均较术前明显升高,且均高于对照组血清BALP含量(P0.05)。结论跟腱钳夹切断法诱导大鼠HO模型方法简便,模型成功率高,适用于创伤性HO的研究。血清Fetuin-A在HO形成阶段均明显下降,而另一种HO相关酶BALP明显升高,提示Fetuin-A在血循环不足,对矿化作用的抑制作用的减弱可能是HO形成的潜在原因。在HO的形成过程中,Fetuin-A与COX2和BMP2两种成骨因子在异位骨中表达均呈现出阳性,Fetuin-A在异位骨局部聚集提示其可能参与HO的形成。第二章塞来昔布和吲哚美辛预防大鼠跟腱HO效果比较目的吲哚美辛和塞来昔布对HO的预防均有一定的作用,但塞来昔布的胃肠道副作用更少,本章实验应用大鼠跟腱切断HO模型,比较两种临床常用的非甾体类药物选择性COX2抑制剂(塞来昔布)与非选择性COX2抑制剂(吲哚美辛)预防HO形成的效果差异,为挑选出更适合临床预防HO的COX2抑制剂提供实验基础。方法选取50只雄性Sprague-Dawley大鼠,6～8周龄,体重190.0±8.5g。在无菌条件下,钳夹并切断大鼠右侧跟腱造成HO模型。随机分成5组(A组,B组,C组,D组,E组,n=10),术后第1天开始,A、B组分别给予塞来昔布2、10mg/(kg-d),C、D组分别给予吲哚美辛2、0mg/(kg-d), E组给予2mL生理盐水,共10周,给药方式为灌胃。术后观察大鼠一般情况,于造模后5、10周摄右后肢侧位X线片,观察新骨形成情况。第10周,大鼠处死后取右侧跟腱组织,行组织学观察,并结合X线片结果,评定异位骨化形成情况；免疫组织学化学染色评价COX2和BMP-2在跟腱局部表达水平。结果实验期间共5只大鼠死亡,其中B组2只,C组1只,D组2只,其余大鼠均存活至实验完成。各组大鼠异位骨化发生率,第5周分别为A组：8/10(80%)：B组：2/8(25%)；C组：8/9(88.9%)；D组：4/8(50%)；E组：8/10(80%)；第10周分别为A组：7/10(70%)；B组：2/8(25%)；C组：8/9(88.9%)；D组：4/8(50%)；E组：9/10(90%)。术后第10周,E组跟腱组织体积最大,质地较其他各组硬,可见软骨样组织；B组跟腱组织体积显著小于其他各组,质地软,未见软骨样组织；A、C、D组跟腱组织体积及质地均介于E、B组间,部分组织中可见软骨样组织形成。第10周经影像学评估后取跟腱组织行病理学HE染色,Masson染色,证实了异位骨组织存在。组织学观察结果,术后10周A组8/10例(80%)、B组2/8例(25%)、C组8/9例(88.9%)、D组4/8例(50%)、E组10/10例(100%)HO形成。最终各组间实验动物HO的发生率,组间差异具有统计学意义(P=0.0030.05)；组间两两比较,发现B与E组间(P=0.0010.005),差异具有统计学意义；其他各组间差异无统计学意义(P0.005)。免疫组织学检查：COX2表达水平在B组、D组和E组之间差异具有统计学意义(P0.05),其它组间差异无统计学意义(P0.05); BMP2表达水平在B组与E组之间,以及在B组与A、C组之间,差异均具有统计学意义(P0.05),其它组间差异无统计学意义(P0.05)。结论塞来昔布10mg/(kg·d)的剂量能够有效降低大鼠术后异位骨化的发生率,应用塞来昔布2mg/(kg·d)或者吲哚美辛2mg/(kg·d);10mg/(kg·d)三种治疗方法对大鼠异位骨化发生率无明显抑制作用。塞来昔布和吲哚美辛均能显著降低HO模型大鼠跟腱COX2表达水平,而塞来昔布10mg/(kg·d)剂量组对于BMP2表达抑制作用更好,对成骨活动抑制作用更强,塞来昔布可能更适合于临床预防HO。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R965

【参考文献】