重组Ⅱ型单纯疱疹病毒（OH2）基因组修饰稳定性研究

发布时间：2018-03-25 23:41

  本文选题：溶瘤病毒　切入点：OH2　出处：《湖北科技学院》2017年硕士论文

【摘要】：目的本课题主要研究重组Ⅱ型单纯疱疹病毒(OH2)基因组修饰的稳定性,为OH2进一步研究提供依据。方法研究中涉及的实验包括DNA提取、PCR产物酶切鉴定单纯疱疹病毒的型别、PCR法验证OH2基因修饰、细胞培养及ELISA检测hGM-CSF含量。PCR产物酶切鉴定单纯疱疹病毒的型别根据Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒的gD糖蛋白保守序列设计,Ⅰ型单纯疱疹病毒在该保守序列上有一个MspI酶切位点,而Ⅱ型单纯疱疹病毒在该保守序列上则没有MspI酶切位点。利用gD糖蛋白基因的保守序列内,设计一对引物,Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒均可扩增出200bp的目的片段,将PCR产物用MspI酶切,Ⅰ型单纯疱疹病毒获得两条条带大小约为130bp及70bp,而Ⅱ型单纯疱疹病毒及OH2酶切后条带大小仍为200bp,可判断OH2未受到广泛存在于人群中的HSV-1污染。PCR法验证基因修饰:根据被敲除或插入的序列及修饰位点上下游病毒核酸序列设计引物进行PCR扩增及电泳,并用电泳图分析OH2基因组中是否剔除ICP34.5基因、ICP47基因及插入hGM-CSF基因。ELISA(夹心法)检测hGM-CSF含量:以OH2培养上清为被检样本,实验目的主要是确定OH2病毒基因组中插入的hGM-CSF基因能否正常表达。选择特异性一抗(hGM-CSF鼠源MAb)及二抗hGM-CSFAb-biotin,孵育后测OD值,以标准品浓度的对数值为横轴,与空白对照孔的OD差值为纵轴,做标准曲线。被测样品稀释合适倍数(40-80倍),使其OD值落在标准曲线类线性范围内,将OD值带入标准曲线中求得hGM-CSF浓度,乘以稀释倍数即为样品中hGM-CSF含量。通过一系列被测样品结果比对,样品中hGM-CSF含量均超过2ng/ml。结果PCR产物酶切鉴定单纯疱疹病毒的型别实验中,Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)经酶切实验出现130bp和70bp两条条带,而Ⅱ型单纯疱疹病毒和OH2PCR条带和酶切条带均只有一条,且为200bp。PCR验证基因修饰实验中OH2在四对引物下扩增,能扩增出对应大小的目的条带。ELISA实验中hGM-CSF浓度在31.25-500pg/ml范围内线性关系良好,且OH2中hGM-CSF表达量均大于2ng/ml。结论OH2经基因修饰后型别未发生改变,修饰的基因稳定存在,插入的hGM-CSF基因能够稳定的表达,且OH2经传代后,型别及修饰的基因稳定存在,hGM-CSF表达稳定。
[Abstract]:Objective to study the stability of recombinant herpes simplex virus type 2 (OH2) genome modification. Methods the experiments involved in the study included the identification of herpes simplex virus (HSV) by type polymerase chain reaction (PCR), which was used to identify herpes simplex virus (HSV) by restriction endonuclease digestion. The type of herpes simplex virus (HSV) was identified by restriction endonuclease digestion of cell culture and ELISA assay. The type of herpes simplex virus was designed according to the gd glycoprotein conserved sequence of herpes simplex virus type 鈪，

本文编号：1665376