有机阳离子转运体介导的普拉克索吸收与排泄机制研究

发布时间：2018-03-28 03:01

  本文选题：普拉克索　切入点：有机阳离子转运体　出处：《华中科技大学》2015年博士论文

【摘要】：近年来,随着分子生物学技术的发展和应用,存在于人体组织细胞中的转运蛋白的分子结构和功能逐渐为人们所认识,它们在营养物质及药物的吸收或外排过程中起着十分重要的作用,并且具有高度的选择性和特异性。有机阳离子转运体(Organic cation transporters, OCTs)表达于肾脏、肝脏和小肠,可以介导许多内源性胺类和药物的吸收与消除。OCT的底物分布广泛,临床应用的药物大约有50%是有机阳离子药物,包括抗心律失常药、抗帕金森药、抗组胺药、β-肾上腺素受体拮抗药等。普拉克索(pramipexole, PPX)在生理条件下是以有机阳离子的形式存在的,但OCT介导的PPX体内过程研究尚不清楚。因此,本课题拟研究OCT在PPX黏膜吸收和肾脏排泄中的作用,并探讨OCT介导的PPX与西咪替丁发生药物相互作用的风险。 本文首先建立了PPX在不同生物基质中的LC-MS/MS定量分析方法。选用d3-PPX作为内标,分别采用蛋白沉淀结合弱阳离子交换固相萃取(Solid phase extraction, SPE)和乙酸乙酯液液萃取的方法处理组织样品和其它生物基质,并通过柱后推注法、预处理后加样法、源内多反应监测(In-source multiple reaction monitoring, IS-MRM)直接评价甘油磷酸胆碱(Glycerophosphocholines, GPChos)和溶血甘油磷酸胆碱(Lyso-glycerophosphocholines, Lyso-GPChos)的方法系统评价了基质效应的产生和消除机制,成功解决了组织样品中内源性成分对分析测定的干扰。采用Ultimate(?) XB-CN柱进行色谱分离,分析时长仅为3.0min,保证了高通量的样品分析。方法学验证结果表明PPX的血浆和组织样品在0.05-100ng/mL浓度范围内线性关系良好,相关系数r0.99,低、中、高三个QC浓度测定的日内、日间精密度(RSD)均小于10.6%,血浆和脑组织的准确度分别为95.2%～105.6%和91.4%～108.2%,提取回收率在80.7%～90.3%的范围内,基质效应偏差为-13.8%～-1.2%,不同条件下稳定性的偏差在±15%的范围内,各项指标均符合生物样品分析方法验证的相关要求。表明该方法准确、灵敏,可以满足体内、体外相关试验的需求。 为考察OCT在PPX肠道吸收中可能发挥的作用,本课题利用扩散池模型研究了PPX在大鼠十二指肠、空肠及回肠的双向转运情况,并通过不同种类的抑制剂试验初步推测PPX可能的转运机制。结果显示在1-50μM的浓度范围内,PPX从AP-BL侧(黏膜侧-浆膜侧)和BL-AP侧(浆膜侧-黏膜侧)跨大鼠不同肠段的累计通透量均呈线性,且分泌方向要高于吸收方向。在回肠中,加入有机阳离子转运体抑制剂(金刚烷胺、胍、普鲁卡因胺、四乙胺、奎宁和维拉帕米)后,PPX的累计通透量明显降低。但是,在十二指肠和空肠的试验中,只有部分抑制剂有抑制效果,表明OCT可能介导了PPX在大鼠肠道的外排转运,且其在小肠的表达存在区域性差异。此外,其他转运体(如P-gp)也可能参与PPX的转运过程。总之,上述结果提示有机阳离子转运体对PPX肠道吸收的贡献较小,提示OCT介导的PPX口服吸收过程中产生临床DDI的风险较低。 由于帕金森疾病(Parkinson's disease, PD)的病变部位位于颅内,PPX口服给药后药物需要透过肠黏膜吸收进入体循环后进而跨过血脑屏障(Blood brain barrier, BBB)才能实现脑内递药,这将会使药物向脑内的递送速率和递送量大大下降,极大地限制了PPX对PD的治疗。基于上述考虑,我们尝试通过改变给药方式来增加PPX向脑内的递送。鼻腔和脑在生理学上存在独特的联系,且鼻腔给药后药物可以直接通过“鼻-脑,,通路绕过BBB进入脑内,从而增加药物的脑内递药。因此,接下来考察了PPX鼻黏膜给药后实现脑内“靶向”递药的可能性。通过小鼠脑组织匀浆法和切片法研究PPX静脉给药、口服给药和鼻腔给药后在血浆和脑组织中的药动学过程,并采用ADAPT5软件对主要的药动学参数进行了拟合。模型拟合结果显示静脉给药和口服给药后PPX在体内呈一级动力学过程,鼻腔给药后药物的转运为饱和吸收过程,但被动扩散也可能是转运机制之一,且约有20%的药物是通过“鼻-脑”通路直接转运入脑的。与口服给药相比,鼻腔给药后脑内PPX的达峰时间从1h提前至30min,Cmax由14.65±0.43ng/g增加至20.37±6.30ng/g,脑靶向效率为口服给药组的1.3倍,证明鼻腔给药可以更快地实现脑内递药,提高脑内药物浓度。小鼠冠状脑切片模型结果显示鼻腔给药后2min-20min每个取样时间点,脑内药物浓度的变化趋势呈先下降后上升的趋势(从“头,,到“尾”),符合鼻腔给药的特点。上述结果提示对PPX而言,鼻腔给药比口服给药更有优势,而且鼻脑直接转运通路对PPX转运入脑发挥了重要作用。 在PPX鼻腔给药的药动学研究基础上,进一步研究了PPX跨鼻黏膜转运的机制。采用牛鼻黏膜离体组织模型和相关的分子生物学技术考察了OCT在PPX跨牛鼻黏膜转运中的作用。结果显示PPX在牛嗅黏膜M-S方向(黏膜侧-黏膜下侧)的转运呈饱和趋势,且高于S-M(黏膜下侧-黏膜侧)方向,米氏方程拟合后,最大转运速率Jmax为18.62±5.46ng cm-2min-1,Km值为44.66±22.65μM。而在呼吸黏膜中两个方向的转运速率基本一致。加入不同种类的有机阳离子转运体抑制剂后,PPX在嗅黏膜中的转运和摄取过程均被抑制,而在呼吸黏膜中,只有摄取被抑制,转运速率无显著变化。提示OCTs尤其是OCT1和OCT2可能主要介导了PPX跨嗅黏膜的转运过程,但在其跨呼吸黏膜的吸收过程中贡献较小。孵育介质不同离子组成对PPX跨牛嗅黏膜转运的影响结果显示该转运过程依赖于跨膜电势,但不依赖于pH梯度和钠离子,进一步从转运体转运机制层面证明了OCT介导了PPX跨鼻黏膜的转运。此外,通过Western Blot技术和免疫组化技术考察了OCT1和OCT2在牛鼻黏膜中的表达情况,结果显示OCT1和OCT2不仅表达在牛鼻黏膜的顶膜侧(黏膜侧),还分布在黏膜下的广大区域,如血管、腺体、淋巴管等,提示这可能与肾脏中OCT1和OCT2的作用相似,主要协助PPX进入或离开这些区域。 对于PPX这个有机阳离子化合物而言,OCT在其肠道吸收过程中存在一定的作用,而在牛鼻黏膜的转运中也发挥着重要作用,这提示我们可以充分利用OCT这个作用靶点进行药物设计或递送。此外,OCT在肾脏也高度表达,PPX吸收后在体内的处置过程是否也跟OCT有关是一个非常值得我们关注的问题。因此,研究了肾脏OCT介导的PPX排泄机制,选择临床常用药物西咪替丁(OCT的底物和竞争性抑制剂)为合并用药药物,采用整体动物模型、离体肾切片模型及转染细胞模型考察西咪替丁对PPX肾脏排泄的影响,并探讨两者发生药物相互作用的风险和机制。整体动物的药动学研究表明当西咪替丁与PPX同时给药后,与对照组相比PPX的血浆AUC(o-12h)增加了2.45倍,平均血浆清除率下降了2.30倍,而PPX在24h内的累积尿药排泄量显著下降,肾脏清除率下降了3倍。表明西咪替丁抑制了PPX的肾脏排泄和在血浆中的清除,提示在肾脏排泄过程中,PPX和西咪替丁是由相同的转运体系统介导的,临床合用西咪替丁可能降低PPX的肾排泄作用。肾切片试验表明OCT抑制剂胍(1mM)、西咪替丁(0.5mM和1mM)以及0.1mM-1mM浓度范围的TEA均对PPX的肾脏摄取有显著抑制作用,且具有浓度依赖性,提示这种相同的转运体系统与OCT相关。转染细胞试验进一步从分子水平证明了西咪替丁是通过抑制OCT2而影响PPX肾脏排泄的,且西咪替丁的Cumax/IC50=0.87,大于国际转运体协会(International Transporter Consootium,ITC)推荐的0.1的标准,提示PPX与西咪替丁在临床上很有可能发生药物相互作用,且该作用主要是由肾脏OCT2介导的。
[Abstract]:In recent years , with the development and application of molecular biology technology , the molecular structure and function of transport proteins present in human tissue cells are gradually recognized . They play a very important role in the absorption or efflux of nutrients and drugs .

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本文编号：1674439