细胞松弛素类化合物体外抗氧化活性及其构效关系初步研究

发布时间：2018-03-28 14:46

  本文选题：细胞松弛素　切入点：细胞损伤　出处：《扬州大学》2014年硕士论文

【摘要】：内生真菌(EndophytEC fungi)是指其在生活史的某一段时期生活在植物组织内,对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。内生真菌种类繁多,能产生结构多样的活性代谢产物,近年来已成为国内外资源开发利用的研究热点之一。 本文所研究的八种细胞松弛素(cytochalasin, Cyt)类化合物是从白茅内生菌球毛壳菌Chaetomium globosum IFB-WZQ和青皮内生菌拟茎点霉Phomopsis sp. IFB-E060固体发酵产物中分离获得的。分别是：chaetoglobosin F (编号WQ-1)、chaetoglobosin Fex (WQ-2)、chaetoglobosin E (WQ-3)、cytoglobosin A (WQ-4)、penochalasin C (WQ-6)、 isochaetoglobosin D (WQ-9)、cytochalasin H (QS-1)和18-methoxycytochalasin J (QS-2)。它们都具有相似的氢化异吲哚-1-酮结构母核,在10位有吲哚或苯环取代。早期在对编号为QS-1化合物抗癌活性研究时,对其它活性也进行了筛选,发现该化合物具有较好的抗氧化活性,且对PC12细胞损伤有一定潜在的保护作用。查阅文献未见有类似的报道。鉴于该类化合物拥有相同的母核,其差异主要在母核和大环的取代基上。为此,本研究应用体外抗氧化模型、H2O2和MPP+损伤细胞模型,考察八种Cyt类化合物是否具有抗氧化活性?其活性强度与结构的关系如何?对自由基及神经毒素引起的细胞损伤是否具有保护作用?通过对该类化合物抗氧化活性构效关系规律的揭示,将为寻找具有强抗氧化活性的先导化合物提供实验资料,对植物内生菌这一新型药用资源的开发利用提供有益思路。主要实验结果如下： 1.清除自由基能力测定 方法：(1)DPPH自由基测定：采用微量比色法测定DPPH自由基吸光度,计算清除率。Cyt类化合物的浓度为10-6,10-4,10-4,10-3,10-2,10-1,5×10-1mmol/L, VE为阳性药。(2)ABTS自由基测定：采用ABTS法微量比色测定ABTS自由基吸光度,计算清除率。以Trolox(维生素E的类似物)为标准对照,计算Trolox当量总抗氧化能力(TEAC)。Cyt类化合物的浓度为10-6,10-5,10-4,10-3,10-2mmol/L。(3)应用SPSS17.0计算半抑制浓度(EC50),反映药物的效价强度,Scott法计算最大效应(Emax),反映药物的效能。采用单因素方差分析和SNK检验,进行抗氧化能力排序。 结果：(1)DPPH自由基清除能力：最大清除率Emax90%的有：WQ-9、QS-1和WQ-1；Emax=35%～60%:WQ-2、WQ-4、WQ-3和QS-2；通过对ECso和Emax统计分析,八种Cyt类化合物的抗氧化作用效价强度排序为：WQ-9=QS-1=WQ-1WQ-2 WQ-4=WQ-3QS-2。效能排序与上述一致。WQ-6EC50无法计算,无清除自由基能力。 (2)ABTS自由基清除能力：依据EC50,八种化合物清除ABTS自由基能力排序为：QS-1=WQ-9=WQ-1WQ-2WQ-3QS-2WQ-4,WQ-6EC50无法计算；依据Emax,效能排序为：QS-1=WQ-9=WQ-1WQ-2=WQ-3=QS-2=WQ-4WQ-6。QS-1的TEAC最大,达到Trolox的746倍,其次是WQ-1和WQ-9为373倍,WQ-4最低为0.001倍,WQ-6无法计算。 结论：除WQ-6外,其余七种化合物均有不同程度的体外抗氧化活性,其中,QS- 1、WQ-9和WQ-1活性最强。 2.抗H202损伤细胞作用研究 方法：通过对不同浓度(50～800μmol/L)H2O2作用不同时间(2,3,4,5,6h)考察,确定H2O2制备PC12细胞损伤模型条件。MTT法测定细胞存活率；比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)活性。分组：(1)对照组：含0.01%DMSO的DMEM溶液；(2)模型组：200μmol/LH2O2溶液；(3)阳性药物组：1000μmol/L VE溶液；(4)Cyt类化合物组：浓度为0.001,0.0025,0.005,0.01,0.05,0.1,0.2μmol/L。EC50(μmol/L)和Emax计算以及统计分析同上。 结果：(1)H2O2损伤PC12细胞模型：以200μmol/L H2O2溶液作用PC12细胞4h,细胞存活率为41.3%±3.6%(P0.001),培养基上清液中LDH活性出对照组16.9±1.4U/dl上升为109.1±2.5U/dl(P0.05)。表明H2O2模型制备成功。 (2)细胞存活率：除WQ-6外,其它化合物均可提高细胞存活率,Emax90%的有：WQ-9、WQ-1和QS-1；Emax=73%～77%:WQ-2,WQ-4和WQ-3。QS-2虽也能提高细胞存活率(P0.01,0.001),但没有量效关系,WQ-6则无效。经统计,效价强度排序为：WQ-1=QS-1=WQ-9WQ-4=WQ-2WQ-3,QS-2和WQ-6无法计算EC50。效能排序为：WQ-9=WQ-1=QS-1WQ-2=WQ-4=WQ-3QS-2WQ-6。 (3)LDH活性：除WQ-6外,与模型组109.1±2.5U/dl相比,其余七种化合物(0.005μmol/L)均可使LDH活性下降(P0.05,0.01)。经统计,LDH作用强度排序为：WQ-9=QS-1=WQ-1=WQ-2WQ-4=WQ-3=QS-2WQ-6。 结论：除WQ-6外,其余七种化合物均可不同程度地抑制H202诱导的PC12细胞损伤,使细胞存活率提高,LDH释放减少。其中WQ-9,QS-1和WQ-1作用最强,WQ-2,WQ-4和WQ-3其次,QS-2无量效关系,WQ-6无效。 3.抗MPP+损伤细胞作用研究 方法：MTT法测定八种化合物细胞毒性,浓度分别为0.005,0.05,0.1,0.2,2.0,20μmol/L。应用500μmol/L MPP+作用PC12细胞48h制备MPP+细胞损伤模型。给药分组：(1)对照组：加含0.01%DMSO的DMEM溶液;(2)模型组：500μmol/L MPP+；(3)cyt类化合物组：浓度为0.005,0.01,0.025,0.05,0.1,0.15,0.2μmol/L。MTT法测定各组细胞OD值,计算细胞存活率；倒置显微镜观察细胞形态；比色法测定LDH活性；流式细胞仪测定ROS含量。EC5o和Emax计算以及统计分析同上。 结果：(1)细胞毒性：八种化合物各浓度组细胞存活率均在90%以上,表明它们对PC12细胞增殖没有明显影响,无细胞毒性。 (2)细胞存活率：模型组细胞存活率明显降低(P0.001)；QS-2不能抑制这种下降,WQ-6(0.005～0.05μmol/L)反增强抑制作用。其余化合物均能不同程度抑制细胞存活率的下降。效价排序为：WQ-1=WQ-9=QS-1WQ-2WQ-4WQ-3,WQ-6和QS-2ECso无法计算。效能强度排序为：QS-1=WQ-1=WQ-9WQ-2=WQ-4=WQ-3WQ-6=QS-2。 (3)LDH活性：除WQ-6、QS-2和WQ-4外,与模型组134.987U/dl相比,其余5种化合物(0.025μmol/L)均可使LDH活性下降(P0.01,0.001)。经统计,作用强度顺序为：WQ-1=WQ-9-QS-1WQ-3=WQ-2WQ-4=QS-2WQ-6。 (4)细胞形态：对照组PC12细胞呈明显的梭形,MPP+模型组细胞形态显著改变,梭形细胞减少或消失,出现球形或圆形,八种化合物预处理后,WQ-1、WQ-2、WQ-9、QS-1能一定程度改善以上形态改变,其它4种化合物作用不明显。 (5)ROS含量比值：与对照组ROS比值为1比较,模型组ROS比值(13.13±0.11)极显著增高(P0.001)。除WQ-6、WQ-4和QS-2外,与模型组相比,WQ-1、WQ-9、 QS-1、WQ-2和WQ-3能显著降低比值(P0.001,0.01)。作用强度顺序为：WQ-1WQ-9 QS-1WQ-3WQ-2=WQ-4。 结论：除WQ-6和QS-2外,其余6种化合物均能不同程度的对抗MPP+诱导的细胞损伤,其中以WQ-1、WQ-9和QS-1作用最强,WQ-2、WQ-3和WQ-4次之。WQ-6不仅不能对抗MPP+诱导的细胞损伤,反有促进细胞损伤作用。 4.八种Cyt类化合物抗氧化作用构效关系分析 根据上述三个实验中各指标的EC50进行构效关系分析：(1)10-吲哚取代或10-苯基取代对抗氧化活性没有影响；(2)化合物抗氧化作用的强弱与结构中的羰基和羟基有关：21位的酯基比18位的甲氧基作用强；6,7位的环醚比醇羟基作用强；20位的羰基比醇羟基作用强；(3)大环内含有吡咯环时不仅无抗氧化活性,甚至可增加细胞损伤。
[Abstract]:Endogenous fungi ( fungi ) refer to fungi which are living in plant tissues for a certain period of life and do not cause obvious disease symptoms to plant tissue . There are many kinds of endogenic fungi , which can produce various active metabolites , which have become one of the hot spots in the development and utilization of resources at home and abroad in recent years .

The eight kinds of cytochalasis ( Cyt ) compounds studied in this paper were Phomopsis sp . from Chaetomium llum sum IFB - WZQ and Penicillium sp . In this study , it was found that the compounds possess the same antioxidant activity , and have some potential protective effects on PC12 cell injury .

1 . Determination of free radical capacity

Methods : ( 1 ) Free radical determination : The concentration of Cyt compound was 10 - 6 , 10 - 4 , 10 - 4 , 10 - 3 , 10 - 2 , 10 - 1 , 5 脳 10 - 1 mmol / L , VE as positive drug . The concentration of Cyt compound was 10 - 6 , 10 - 5 , 10 - 4 , 10 - 3 , 10 - 2mmol / L . ( 3 ) The maximal effect ( Emax ) was calculated by using SPSS 17.0 .

Results : ( 1 ) Free radical scavenging ability : The maximum clearance rate of Emax90 % was WQ - 9 , QS - 1 and WQ - 1 ;
Emax = 35 % ~ 60 % : WQ - 2 , WQ - 4 , WQ - 3 and QS - 2 ;
Through the statistical analysis of ECso and Emax , the effect valence of eight Cyt compounds was ranked as WQ - 9 = QS - 1 = WQ - 1WQ - 2 WQ - 4 = WQ - 3QS - 2 . The efficacy sequencing was consistent with that above . WQ - 6EC50 could not be calculated without scavenging free radicals .

( 2 ) ABTS free radical scavenging ability : According to EC50 , the ability of scavenging free radicals ABTS from eight compounds was : QS - 1 = WQ - 9 = WQ - 1WQ - 2WQ - 3QS - 2WQ - 4 , WQ - 6EC50 could not be calculated ;
According to Emax , the efficiency ranking is : QS - 1 = WQ - 9 = WQ - 1WQ - 2 = WQ - 3 = QS - 2 = WQ - 4WQ - 6 . QS - 1 has a maximum TEAC of 746 times , followed by WQ - 1 and WQ - 9 373 times , WQ - 4 is at least 0.001 times , and WQ - 6 cannot be calculated .

Conclusion : In addition to WQ - 6 , the other seven compounds have different levels of antioxidant activity in vitro , including QS - 6 .

1 銆，

本文编号：1676786