两种新型抗菌性哌嗪聚合物的制备及生物学评价

发布时间：2018-04-03 08:20

本文选题：哌嗪聚合物　切入点：抗菌　出处：《重庆大学》2015年博士论文

【摘要】：细菌在给人类带来益处的同时,也时刻威胁着人类的生活和健康。面对致病菌的威胁,抗生素的使用必不可少。然而,随着细菌耐药性的愈演愈烈以及有效抗生素的日趋减少,开发不依赖于传统抗生素结构修饰或改造的新型抗菌材料具有十分重要的意义。针对这个问题,本研究在比较了现有无机抗菌剂和有机抗菌剂后,选择高分子抗菌材料为研究对象,以哌嗪(PA)和乙二胺四乙酸二酐(EDTAD)为原料设计并制备了一种具有独特结构的新型哌嗪聚合物PE。首先,利用傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)、核磁共振波谱仪(NMR)、元素分析仪(EA)、差示扫描量热计(DSC)、热重分析(TG)以及光学显微镜等对其基本结构和性能进行了系统表征;接着,考察了PE对革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌(S.aureus)和革兰氏阴性菌-大肠杆菌(E.coli)及相应生物膜形成过程的影响;然后,利用扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、FTIR、紫外分光光度计(UV)、酶标仪、凝胶电泳等对PE的抗菌作用机理进行了探讨;最后,采用SD大鼠乳鼠颅盖骨成骨细胞检测了PE的细胞毒性。在对PE的抗菌性能和细胞毒性进行了系统的评价后,本研究进一步将与成骨细胞功能表达相关的生物活性因子MGFCt24E引入到PE的分子结构中以期制备出另一种具有更小细胞毒性的新型抗菌性哌嗪聚合物PEM。对于所获得的产物,采用FTIR、NMR、EA、氨基酸分析仪(AAA)、DSC及TG等对其基本结构和性能进行了表征;然后,评价了PEM的体外抗菌性能和细胞毒性,并与PE进行了系统的比较;最后,将两种新型哌嗪聚合物PE和PEM与具有良好生物相容性和骨传导性的多孔羟基磷灰石(HA)陶瓷支架进行复合,并对所得复合物的抗菌性能和生物相容性进行了初步评价。主要研究内容和结论如下所述:①以PA和EDTAD为原料通过一种简单且绿色的方法制备了一种新型的哌嗪聚合物PE:1)FTIR、13C NMR和EA的分析结果表明,PE分子中的PA和EDTAD基本以1:1进行反应,最后形成了两端为羧基封端的聚合物。2)热分析结果显示PE的玻璃化转变温度(Tg)为50.09℃,热分解温度为200℃。3)当PE溶液处于较低温度时,由于分子内和分子间氢键的作用,会形成直径约为5μm的凝胶,而随着温度的升高(45℃),该凝胶态逐渐转变为溶液态。②将新型哌嗪聚合物PE作用于E.coli和S.aureus,以考察其相应的抗菌性能,检测指标主要包括:细菌敏感性、MIC和MBC值,细菌生长抑制情况以及与细菌生物膜形成过程相关的游离细菌和粘附细菌的快速杀灭作用,细菌生物膜生长抑制情况等。除此之外,还考察了环境因素对pe抗菌性能的影响。所得结果如下所示:1)与环丙沙星对照组相比,pe能够更好地抑制和杀灭e.coli和s.aureus,且其对e.coli的作用效果更明显。2)pe对e.coli和s.aureus的mic值受到环境ph值和最初细菌接种量的影响,具体表现为:随着环境ph值的上升,pe对两种细菌的mic值均呈现出先增大后减小的趋势;随着两种细菌初始接种量的增加,pe相应的mic值增大。3)pe能够显著的影响细菌生物膜的形成过程,具体表现为:与环丙沙星对照组相比,pe能够浓度依赖性的对游离细菌和粘附细菌起到更好的快速杀灭作用,且其对细菌生物膜生长的抑制作用与环丙沙星对照组相当。③将一定浓度的pe作用于e.coli和s.aureus一段时间后,采用sem和tem观察细菌形态的变化;采用ftir和uv检测细菌细胞壁结构成分的改变;检测培养液中k+和mg2+的浓度以及乳酸脱氢酶(ldh)和β-半乳糖苷酶的活性等以考察pe对细菌细胞膜完整性的影响;检测菌体内dna的含量和破损情况以了解pe对细菌遗传物质的影响。结果如下所示:1)pe会直接作用于细菌的细胞壁和细胞膜,破坏其结构,并使得细菌内容物泄漏,dna丢失。2)pe会直接作用于细菌的遗传物质dna,使其发生断裂,并最终影响细菌的分裂增殖。④将pe与sd大鼠乳鼠颅盖骨成骨细胞进行体外培养,以检测其细胞毒性,具体包括pe对成骨细胞形态、铺展、增殖、周期、分化及矿化的影响,所得结果如下所示:1)pe作用于成骨细胞4h后几乎不会对其铺展造成影响,而随着培养时间延长到24h时,pe对成骨细胞铺展的影响呈现出浓度依赖性,但是均优于环丙沙星对照组。2)pe会浓度依赖性地抑制成骨细胞的增殖;其主要作用方式包括:一、当pe浓度达到一定值后,会对成骨细胞的铺展造成影响,并减少最初粘附的细胞数目;二、阻碍成骨细胞进入s期,堆积在g1期,从而出现g2/m期阻滞现象,并最终导致成骨细胞的增殖受到抑制。3)pe会浓度依赖性地影响成骨细胞的成熟、分化和矿化,且其抑制作用小于环丙沙星对照组。⑤在系统地评价了pe的体外抗菌性能和细胞毒性后,以edc和nhs为缩合剂,将力生长因子mgf-ct24e引入到pe的分子结构中从而制备出了另一种新型哌嗪聚合物PEM:1)FTIR、13C NMR、EA和AAA的分析结果表明,MGF-Ct24E已经在PE中成功引入,且其含量约为1.39μmol/g。2)热分析结果显示PEM的Tg为36.56℃,热分解温度为315℃。⑥测试了PEM的体外抗菌活性和细胞毒性,并与PE进行了系统的比较,所得结果如下所示:1)与PE相比,PEM对E.coli和S.aureus的MIC值和MBC值有所增加,但是对应浓度的PEM却表现出了比PE更优的抗菌性能。2)SEM和TEM的结果显示,PEM与PE具有相似的抗菌机理,即破坏细菌的细胞壁和细胞膜结构,并使得遗传物质DNA发生断裂或呈现浓缩紧张态。3)细胞毒性实验结果表明,MGF-Ct24E的引入不仅会降低材料的细胞毒性,而且会发挥MGF-Ct24E相关的生物学功能。⑦将针状的HA和球状的HA按照一定比例进行混合后烧结,获得具有一定力学强度的多孔HA陶瓷支架,将PE和PEM分别与该支架进行复合后评价所得复合物的抗菌性能和生物相容性,结果如下所示:1)FTIR和SEM结果显示,PE和PEM已经与多孔HA陶瓷支架成功复合。2)抗菌性能测试结果表明,复合物能够显著的抑制或杀灭与其直接接触的细菌。3)细胞毒性实验结果表明,与空白对照组相比,复合物可以显著的促进成骨细胞的增殖和总蛋白的分泌。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R943

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