基于诱导表位印迹策略的肿瘤靶向递药系统研究

发布时间：2018-04-03 18:52

  本文选题：诱导表位　切入点：印迹　出处：《西南大学》2017年硕士论文

【摘要】：近年来,选择合适的配体如多肽、抗体、核酸适配体等修饰于递药系统,用于特异性的识别肿瘤细胞膜表面特定的受体并与之结合,是实现肿瘤靶向的重要策略之一。分子印迹技术是以制备分子印迹聚合物为目标,选择合适的模板分子,人工合成具有特异性分子识别功能物质的一种技术。分子印迹聚合物与其模板重结合的过程类似于拿“钥匙”开“锁”的过程,与天然抗体相比,分子印迹聚合物作为“人工抗体”具有制备可控性强、理化性质稳定、抗干扰能力强等优点,并且具有一定三维空间结构的模板印迹聚合物与模板分子进行特异性结合的能力远远强于一级结构的模板印迹聚合物。本课题组前期将分子印迹技术与多肽设计相结合,提出以具有二级结构的多肽作为模板分子的构象表位印迹策略,并将其用于肿瘤靶向药物递送。其选取p32蛋白末端关键氨基酸序列嫁接于蜂毒明肽apamin,设计合成α螺旋构型的多肽并将其作为模板分子制备印迹纳米粒,用于p32蛋白高表达的肿瘤靶向药物递送。然而,p32蛋白末端为特殊的α螺旋结构,生物体内大部分膜蛋白的末端没有特定的二级结构,使得这一策略有了局限性。那么对于大部分末端无固定二级结构的膜蛋白,我们可否将其末端诱导为一定的二级结构,以期其与印迹纳米粒发生较强的特异性结合呢?基于此,本论文特提出诱导表位印迹策略,即选择合适的诱导剂将线性肽诱导为α螺旋结构,并以“α螺旋化”的多肽作为模板合成分子印迹纳米粒,该纳米粒可将其相应的膜蛋白末端诱导趋向于α螺旋,并发生较强的特异性结合作用。以叶酸受体(Folate receptor,FR)为模型,多种肿瘤细胞表面高表达叶酸受体,常将其作为靶点用于肿瘤靶向药物递送,而叶酸受体蛋白N端多肽链(FN)为无规则线性结构,选择合适的诱导剂将FN肽诱导为α螺旋,以“α螺旋化”的FN肽为模板分子,合成分子印迹纳米粒(MIPNP-F),特异性的识别并诱导细胞膜表面FR末端多肽链的二级结构趋向于α螺旋,并进行特异性结合,从而实现肿瘤靶向。更值得关注的是,叶酸(Folic acid,FA)与FR的结合口袋远离FR末端,可有效避免游离叶酸对MIPNP-F的靶向效果产生竞争性抑制。本论文第一部分对诱导表位印迹策略进行可行性分析。分别以apamin(α螺旋结构)及其线性衍生物linear apamin(apamin的4个半胱氨酸替换为丙氨酸)为模板分子,采用沉淀聚合法制备具有α螺旋“孔穴”的分子印迹纳米粒(MIPNP-A)和具有无规则线性“孔穴”的分子印迹纳米粒(MIPNP-L),探究MIPNP-A和MIPNP-L与apamin及linear apamin间的相互作用发现,MIPNP-A可将linear apamin诱导为α螺旋,并发生较强的特异性结合,而MIPNP-L对apamin的结合作用则较弱。该结果提示,具有α螺旋结构“孔穴”的印迹纳米粒可将其线性模板肽诱导为α螺旋并发生较强的特异性结合作用,反之,有线性“孔穴”的印迹纳米粒对α螺旋的模板肽作用则较弱,初步表明在构象表位印迹基础上提出的诱导表位印迹策略具备一定可行性。为进一步探索将诱导表位印迹策略用于肿瘤靶向药物递送,以FR高表达的肿瘤靶向为代表,选择FR末端一段关键序列,设计合成FN肽,测定其二级结构,证明其本身为无规则线性结构,50%的三氟乙醇(2,2,2-Trifluoroethanol,TFE)可将其诱导为α螺旋。以丙烯酰胺和2-(三氟甲基)-丙烯酸为功能单体,以N,N’-亚甲基双丙烯酰胺和丙烯酸三氟乙酯为交联剂,以FN肽为模板分子,在50%TFE溶剂中合成具有α螺旋“孔穴”的分子印迹纳米粒(MIPNP-F),用动态光散射法测定其粒径为(78.3±2.5)nm,多分散系数为(0.175±0.023),通过扫描电镜和透射电镜观察显示纳米粒为分布均匀,外观圆整的球形结构,提示MIPNP-F制备成功,为以MIPNP-F为载体用于叶酸受体高表达的肿瘤靶向药物递送奠定了基础。第二部分主要对MIPNP-F进行体内外功能评价和作为递药载体的安全性考察。多肽结构诱导和体外结合实验显示,MIPNP-F可将其线性模板肽的α螺旋比例由5%诱导为36%,并发生特异性结合。纳米粒-细胞相互作用实时分析结果显示,MIPMP-F与He La细胞作用有更高的信号响应值,KD值(2.81E-8±5.81E-10)也显著低于非印迹纳米粒(Non-imprinted polymer nanoparticles,NIPNP)与HeLa细胞作用的KD值(2.15E-5±3.05E-7)。用荧光显微镜观察和流式细胞仪测定MIPNP-F的细胞摄取情况发现,在FR高表达的HeLa、KB和PANC-1细胞上,MIPNP-F的细胞摄取量分别为NIPNP的3.89倍、4.05倍和3.46倍,而在FR低表达的A549和MCF7细胞上,MIPNP-F和NIPNP的细胞摄取量没有表现出明显差别。探索MIPNP-F胞吞机制发现,其入胞途径与叶酸修饰的纳米粒(FA-NP)基本一致,主要通过穴样凹陷内吞和大胞饮途径内吞,初步表明MIPNP-F可经叶酸受体介导入胞。小动物活体成像检测纳米粒的体内分布表明,MIPNP-F的肿瘤积累量明显高于NIPNP。将光敏剂亚甲基蓝包载于纳米粒中,用光动力疗法进行细胞药效学评价发现,在观察期内MIPNP-F组的IC50为2.12μg·mL-1,明显低于NIPNP组IC50值3.96μg·mL-1;进行体内药效学考察发现,MIPNP-F给药组裸鼠皮下瘤大小基本维持不变,而NIPNP组肿瘤则呈增长趋势。更值得关注的是,在细胞与游离叶酸孵育以及在裸鼠肿瘤附近给予高浓度叶酸预处理前提下,与FA-NP相反,叶酸对MIPNP-F的体内外靶向效果没有产生竞争性抑制。对印迹纳米递药载体进行体内外安全性评价,结果初步显示,治疗剂量的空白印迹聚合物纳米粒对细胞和裸鼠机体没有明显毒性作用。以上细胞和动物实验表现出MIPNP-F体内外良好的靶向性,出色的药效学性质及生物安全性,展现出将其作为递药载体用于肿瘤靶向光动力治疗的巨大潜力。综上所述,本文在构象表位印迹的基础上,提出诱导表位印迹策略,并将其作为载体用于肿瘤靶向药物递送。在一定程度上解决了大部分膜蛋白质域结构灵活多变,难以靶向的问题;拓宽了受体识别的概念,为分子印迹技术的应用及肿瘤靶向递药系统的设计提供了新的借鉴。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R943

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本文编号：1706480