多靶点酪氨酸激酶抑制剂AL-8326抗肿瘤活性及机制研究

发布时间：2018-04-06 01:39

本文选题：酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine　切入点：Kinase　出处：《浙江大学》2014年硕士论文

【摘要】：研究目的：评价新型多靶点酪氨酸激酶抑制剂AL-8326的体内外抗肿瘤活性,并研究AL-8326发挥抗肿瘤活性的潜在分子机制。研究方法： 1.AL-8326的体内外抗肿瘤活性评价：1)体外抑制细胞增殖实验中,悬浮细胞采用四氮唑盐还原法(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT),贴壁细胞采用磺酰罗丹明B蛋白染色法(Sulforhodamine B, SRB)来观察AL-8326对16株肿瘤细胞(包括2株卵巢癌细胞,4株白血病细胞,2株乳腺癌细胞,1株肺癌细胞,3株肝癌细胞,1株肾癌细胞,1株宫颈癌细胞,1株结肠癌细胞以及1株胃癌细胞)体外增殖抑制作用。2)建立人白血病HL-60、人卵巢癌SKOV3、人肝癌Bel-7402以及人宫颈癌Hela裸小鼠移植瘤模型,评价AL-8326的体内抗肿瘤活性。 2.AL-8326的抗肿瘤作用机制研究：1)ELISA法测定AL-8326是否为ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂。2)Western bloting法检测AL-8326对经hVEGF165. b.FGF刺激后内皮细胞(HUVEC)VEGFR.FGFR下游信号转导通路关键分子Erkl/2.Akt的磷酸化影响。3)流式细胞术结合Annexin V-FITC/Propidiumiodide(PI)染色检测AL-8326作用肿瘤细胞后细胞凋亡情况。4)Western blotting法检测细胞内凋亡相关蛋白的表达情况。5)流式细胞术结合Propidium iodide(PI)染色检测细胞经AL-8326作用细胞后对细胞周期的影响。6)Western blotting法检测细胞内周期相关蛋白cdc25B.cyclin B和cdc2的表达情况。7)采用激酶检测试剂分析AL-8326对Aurora-A/B/C的抑制作用。8)鸡胚绒毛尿囊膜法(CAM)检测AL-8326对新生血管生成的影响。9)HUVEC细胞Transwell小室迁移模型及划痕修复实验检测AL-8236对细胞侵袭能力的影响。研究结果： 1.AL-8326在体内外具有广谱高效的抗肿瘤活性：1)AL-8326对16种肿瘤细胞表现出很强的体外抑制增殖作用,作用72h后半数抑制浓度(IC50值)分别为：卵巢癌细胞SKOV3(17.1±0.57μM)、卵巢癌细胞A2780(2.32±0.11μM)、急性髓性白血病细胞HL.60(4.84±0.45μM)、急性淋巴性白血病细胞Molt-4(4.85±1.43μM)、慢性髓性白血病细胞K562(6.62±0.29μM)、淋巴瘤细胞U937(10.0±2.28μ)、乳腺癌细胞SKBR3(12.2±2.00μM)、乳腺癌细胞MDA.MB.231(7.77±0.02μM)、高转移肺癌细胞95-D(4.92±2.26μM)、肝癌细胞BEL-7402(2.04±1.91μM)、肝癌细胞HepG2(8.29±2.32μM)、肝癌细胞SMMC.7721(8.51±1.61μM)、肾癌细胞786-0(10.1±3.97μM)、结肠癌细胞HCT-116(10.4±3.18μtM)、宫颈癌细胞Hela(11.2±2.71μM)和胃癌细胞SGC7901(6.24±0.90μM)。AL-8326对16株肿瘤细胞的平均IC50值为7.96±1.63μM。同时,阳性对照药Sunitinib对16株肿瘤细胞的平均IC50值为6.13±1.72μM。结果说明,AL-8326具有广谱体外抗肿瘤活性,对多种肿瘤细胞的体外增值抑制作用稍弱于阳性对照药Sunitinib。2)采用人白血病HL-60裸小鼠移植瘤模型,评价AL-8326体内抗肿瘤活性,给药14天后,阳性对照药Sunitinib45mg/kg组、AL-832645mg/kg、AL-832615mg/kg、 AL-83265mg/kg组肿瘤抑瘤率(%)分别为48.8%、84.2%、74.0%和47.9%,T/C值分别为74.8%、24.1%、36.3%、64.8%。采用人卵巢癌SKOV3裸小鼠移植瘤模型,评价AL-8326体内抗肿瘤活性,给药23天后,阳性对照药Sunitinib45mg/kg组、AL-832645mg/kg、AL-832615mg/kg、AL-83265mg/kg组T/C(%)值分别为36.4%、12.9%、30.7%和72.0%,抑瘤率(%)分别为72.7%、89.6%,80.4%和38.1%；采用人肝癌Bel-7402裸小鼠移植瘤模型,评价AL-8326体内抗肿瘤活性,给药27天后,阳性对照药Sunitinib45mg/kg组、AL-832645mg/kg、AL-832615mg/kg、AL-83265mg/kg组T/C(%)值分别为49.4%、26.2%、35.9%、53.3%,抑瘤率(%)分别为54.8%、74.7%、62.8%和47.5%；采用人宫颈癌Hela裸小鼠移植瘤模型,评价AL-8326体内抗肿瘤活性,给药19天后,阳性对照药Sunitinib45mg/kg组.AL-832645mg/kg、 AL-832615mg/kg、AL-83265mg/kg组T/C(%)值分别为45.2%、23.3%、38.9%、58.0%,抑瘤率(%)分别为42.7%、76.9%、53.5%和27.9%；以上结果证实,AL-8326在45mg/kg和15mg/kg剂量下均可显著抑制HL-60、SKOV3、Bel-7402和Hela肿瘤的生长,并具有优于相同剂量Sunitinib的体内抗肿瘤活性。 2.AL-8326可从诱导细胞凋亡、周期阻滞,抑制新生血管生成等方面发挥抗肿瘤活性：1)AL-8326是ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂：采用ELISA法证实,随着ATP浓度的增高(2、10、25、50、100、200μM),AL-8326对VEGFR-2的抑制能力呈ATP浓度依赖性降低,说明AL-8326是一种ATP竞争性的VEGFR-2抑制剂。2)Western blotting结果显示,AL-8326能显著抑制HUVEC细胞经hVEGF165以及b-FGF刺激后VEGFR及FGFR下游信号转导通路的关键分子Erkl/2、Akt的磷酸化,且该作用强于相同浓度的阳性对照药Sunitinib。3)Al-8326能够通过诱导细胞凋亡及产周期阻滞发挥抗肿瘤活性：选用5、10、15和20gμM AL-8326作用HL-60和SKOV3细胞48小时,流式细胞术检测HL-60及SKOV3细胞凋亡率,分别为25.8%、41.9%、57.8%、78.5%和31.1%、48.0%、52.4%、58.3%,说明AL-8326能够诱导HL-60和SKOV3细胞凋亡,且凋亡率呈浓度依赖性增加；同时,使用2.5、5、10、15和20μM AL-8326作用HL-60及SKOV3细胞24小时,能引起凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP的切割及累积,且AL-8326对PARP的激活与同浓度的阳性药Sunitinib相类似；流式细胞术检测5、10和20μMAL-8326作用HL-60.SKOV3及U937细胞48小时后细胞周期变化情况,结果显示,AL-8326可诱导SKOV3细胞G2/M期阻滞,在5、10和20μM给药情况下G2/M期所占百分率为28.5%、67.4%和70.4%,与同浓度的阳性药Sunitinib相比,AL-8326引起G2/M期阻滞率稍高；同时,AL-8326可诱导HL-60和U937细胞形成多倍体,在5、10和20μM给药条件下HL-60和U937形成的多倍体所占比率分别为87.4%、83.9%、18.3%以及13.7%、67.2%和66.4%,而阳性药Sunitinib以及Taxol则不会产生该作用；2.5、5、10、15和20μMAL-8326分别作用HL-60及SKOV3细胞24小时,Western blotting结果显示,AL-8326能引起cdc25B、cyclin B和cdc2的下调,且AL-8326对cdc25B、cyclin B和cdc2的下调作用与同浓度的阳性药Sunitinib相类似。4)AL-8326能够抑制Aurora-B激酶活性：激酶分析结果显示,AL-8326在分子水平能显著抑制Aurora-B激酶活性,且具有明显的浓度依赖性,半数抑制浓度(IC50)为47nM；而AL-8326对Aurora-A、Aurora-C激酶活性并没有明显的抑制作用(IC501,000nM).5)AL-8326能够AL-8326抑制新生血管生成和细胞迁移：AL-8326对鸡胚绒毛尿囊膜的新生血管形成具有显著的抑制作用,与同浓度的阳性药Sunitinib相比,AL-8326引起新生血管抑制作用更为明显；HUVEC细胞Transwell小室迁移模型及划痕修复实验证明,AL-8326可以显著抑制HUVEC内皮细胞的迁移,且与同浓度的Sunitinib相比,AL-8326对HUVEC细胞的迁移能力抑制作用稍强。结论： AL-8326具有广谱的体外抗肿瘤活性,同时在体内能发挥优于上市药物舒尼替尼(Sunitinib)的抗肿瘤活性。AL-8326对包括VEGFR,FGFR,PDGFR和Ret在内的多种酪氨酸激酶具有抑制作用,且通过ATP竞争性与酪氨酸激酶结合,抑制激酶相关下游信号通路的激活,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡周期阻滞,同时AL-8326也可以通过抑制Aurora-B激酶活性诱导肿瘤细胞形成多倍体从而发挥其抗肿瘤活性。此外,AL-8326还可以抑制新生血管生成并能抑制肿瘤细胞的迁移运动能力。综上所述,AL-8326是一个结构全新、抗肿瘤作用明确且毒性反应较小的多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂,完全具备进一步开发成为新型抗肿瘤药物的潜力,拥有很好的临床应用前景。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R965

【参考文献】