氟胞嘧啶耐药基因筛选及其机制研究

发布时间：2018-04-09 04:16

本文选题：筛选　切入点：蛋白表达差异性　出处：《东华大学》2017年硕士论文

【摘要】：抗真菌药物耐药性已成为亟需解决的全球性难题,耐药性引起的死亡率较高且难以治疗,也是临床抗真菌药物治疗失败的主要原因。所以深入研究真菌耐药机制并能控制和解决其耐药性的发生,对国民的身体健康和社会的和谐发展有着非常重要的意义。临床真菌对氟胞嘧啶(5-FC)易产生耐药性,但机制非常复杂,本文试图开展该药物耐药性新机制研究。首先,在对5-FC耐药菌株的筛选以及之后SDS-PAGE对高耐药性菌株酵母总蛋白表达特性分析进行初步探索之后,我们发现抗性菌株相比于野生型菌株蛋白含量明显发生改变,但是通过诱变筛选的菌株对5-FC耐受性不具有特异性,特别是所得到的5-FC高耐受性菌株蛋白水平所表现出的差异可能是许多不同的基因共同调节的结果。为了筛选出对5-FC有特异耐受性的靶向基因,我们用过表达基因库来筛选特异性抗5-FC的靶向基因,以期寻找5-FC耐受机制新途径。其次,我们通过酿酒酵母必需基因过表达库的筛选,发现过表达Sc GFA1基因后明显提高了细胞对5-FC的耐受性。已知GFA1基因参与了细胞壁中几丁质的合成,首先用卡尔科弗卢尔荧光增白剂(CFW)染色法和荧光分光光度计检测了细胞中几丁质的含量,发现过表达Sc GFA1提高了细胞中几丁质的合成,而5-FC处理后细胞中几丁质含量明显下降。我们推测过表达Sc GFA1对5-FC耐药性的原因可能与细胞中几丁质的合成有关。为此,进一步克隆构建了细胞几丁质合成代谢途径相关的一系列基因CRH1,GNA1,CHS2,PCM1,QRI1和CDA1,发现在酿酒酵母野生型菌株中过表达这些基因对5-FC也具有耐受性。值得注意的是几丁质合成酶缺失突变体chs1Δ,chs3Δ对5-FC非常敏感,意味着几丁质的合成与5-FC的耐受性具有密切的相关性。此外我们在几丁质合成代谢的补救途径中添加葡萄糖胺(Glc-N),发现其可以使野生型菌株BY4741对5-FC具有耐受性,而Sc GFA1过表达菌株对5-FC的耐受性受到抑制。此外,我们发现甘露糖蛋白合成代谢也影响几丁质的合成,但其途径十分复杂至今还不清楚。我们观察到甘露糖蛋白合成相关的某些基因CWP2,VRG1 and MNT2的缺失也增加了几丁质的合成。而甘露糖蛋白合成相关缺失突变体cwp2Δ,vrg1Δ和mnt2Δ过表达ScGFA1也对5-FC具有耐受性。通过进一步克隆构建甘露糖蛋白合成相关基因CWP2,VRG4和MNT2,发现上调甘露糖蛋白的合成也能产生对5-FC的耐受性。最后我们利用高效液相色谱法(HPLC)检测了细胞中糖核苷酸UDP-GLC的含量,发现5-FC处理后细胞中UDP-GLC的含量明显增加,结合前期我们发现的5-FC能降低细胞中几丁质的合成,因此实验结果表明5-FC可能通过抑制细胞壁中糖核苷酸的分解,进一步导致了细胞壁中几丁质含量的下降,而过表达Sc GFA1可以抵抗和弥补5-FC造成的这种损失。最后在酿酒酵母中异源表达致病酵母白色念珠菌的CaGFA1,发现其对5-FC的耐受性同样存在,并且白色念珠菌经5-FC处理后,细胞中几丁质含量也明显下降。因此过表达GFA1赋予5-FC的耐受性在致病酵母白色念珠菌中也同样具有保守性,说明这是个保守的跨物种的机制。其结果为今后进一步研究几丁质合成代谢介导的5-FC的耐药机制奠定了基础。
[Abstract]:In order to find a new way to improve the resistance of 5 - FC to 5 - FC , we have found that overexpression of Sc GFA1 can improve the tolerance of 5 - FC . The results provide a basis for further research on the drug resistance mechanism of 5 - FC mediated by chitin synthesis .

【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R978.5

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