cRGD-siVEGFR2分子抑制血管生成的体外药效学研究

发布时间：2018-04-19 08:56

  本文选题：cRGD-siRNA + VEGFR2　； 参考：《南方医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：肿瘤生长依赖于新血管生成,当肿瘤组织拥有独立的血管供应,肿瘤细胞就获得了转移扩散的能力。RNA干扰(RNA interference,RNAi)作为一项新兴技术,被广泛应用于恶性肿瘤的基因治疗研究领域。本课题设计合成cRGD-siVEGFR2分子,考察分子体外生物学功能,探讨其抑制血管生成的作用效果及作为肿瘤靶向治疗药物的可能性。方法1、原代人脐静脉内皮细胞模型的建立胶原酶消化法分离提取细胞,免疫荧光检测Ⅷ因子进行细胞鉴定,流式细胞术检测CD31含量进行纯度检测,并探索最佳的血清饥饿条件。2、cRGD-siRNA分子的合成cRGD通过linker与siRNA正义链5'端共价偶联得cRGD-siRNA分子,分别用液相色谱-质谱联用技术和反相高效液相色谱进行结构鉴定和纯度检测。3、cRGD-siVEGFR2分子体外功能研究(1)血清稳定性研究:siVEGFR2、cRGD-siVEGFR2、cRGD-siNC 分别与鼠血清混匀孵育,琼脂糖凝胶电泳后观察条带完整性。(2)细胞毒性研究:1000nM、2000nM、3000nMRPM 或 cRGD-siNC 分子转染细胞,CCK8测定细胞活力。(3)靶向沉默功能研究:100nM、500nM、800nM、1000nM cRGD-siVEGFR2、阳性对照 Lipo/siVEGFR2(100nM)、Lipo/cRGD-siVEGFR2(100nM)、阴性对照cRGD-siNC(1000nM)转染细胞,RT-PCR法和western-blot法检测分子靶向沉默效果。(4)对细胞增殖迁移的影响:100nM、500nM、800nM、1000nM cRGD-siVEGFR2、Lipo/siVEGFR2、cRGD-siNC 转染细胞,CCK8 法和 EdU 法测定细胞增殖活力,划痕实验和transwell实验测定细胞迁移能力。(5)对细胞体外成管的影响:1000nM cRGD-siVEGFR2、Lipo/siVEGFR2、cRGD-siNC转染细胞后接种于基质胶上进行细胞分化实验,观察小管形成情况。结果1、原代人脐静脉内皮细胞提取成功,细胞呈多边形,铺卵石状排列。Ⅷ因子呈阳性表达,CD31含量高为99.67%。不同血清浓度培养基饥饿培养细胞6h可得到70%左右G0/G1期细胞;12h可得80%～90%;18h、24h可得95%左右。2、cRGD-siRNA分子合成成功,其实测分子质量与理论分子质量基本一致,纯度约为80%。3、cRGD-siVEGFR2分子体外功能研究(1)血清稳定性:siVEGFR2分子24h几乎完全降解,而cRGD-siVEGFR2与cRGD-siNC分子72h仅有部分降解。(2)细胞毒性:RPM分子组O.D.值保持在1.0左右;cRGD-siNC组O.D.值保持在0.85以上,1000nM时O.D.值在1.0左右。(3)靶向沉默功能:cRGD-siVEGFR2分子可以下调VEGFR2mRNA和蛋白的表达,且其作用呈浓度依赖。(4)对细胞增殖迁移的影响:cRGD-siVEGFR2分子可呈时间和浓度依赖的抑制细胞增殖迁移。(5)对细胞体外成管的影响:HUVECs在基质胶上生长6h可形成条索状结构,生成分支,并闭合成管。cRGD-siVEGFR2分子可以有效减少管状结构形成。结论1、胶原酶消化法可收获高质量的HUVECs,无血清培养12h为最佳饥饿条件。2、cRGD通过linker与siRNA正义链5'端共价偶联,可得到纯度高、稳定性好、基本无毒的cRGD-siRNA分子。3、cRGD-siVEGFR2分子可以靶向沉默目的基因mRNA及蛋白的表达,有效抑制HUVECs的细胞增殖迁移及体外成管。
[Abstract]:Tumor growth depends on neovascularization. When tumor tissues have independent vascular supply, tumor cells acquire the ability of metastasis and diffusion. RNA interference RNA interference RNAi (RNAi), as a new technology, has been widely used in gene therapy of malignant tumors.In this paper, we designed and synthesized cRGD-siVEGFR2 molecule, investigated its biological function in vitro, and discussed the effect of inhibiting angiogenesis and the possibility of using it as tumor target therapy.Methods 1. The primary human umbilical vein endothelial cell model was established. Collagenase digestion method was used to isolate and extract cells. Factor 鈪，

本文编号：1772427