海洋石头鱼毒素检测及抗毒素制备研究

发布时间：2018-04-19 15:58

本文选题：石头鱼毒素 + neoVTX　；参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2016年硕士论文

【摘要】：能够分泌蛋白类毒素的海洋生物种类繁多,主要包括腔肠动物门(如海葵、水母等)、软体动物门(如芋螺、海兔等)、棘皮动物(如海星、海胆等)、有毒鱼类(如刺毒鱼和毒腺鱼)以及海蛇等。石头鱼(Synanceia)是海洋鱼类中毒性最强的鱼类之一,主要存在于太平洋和印度洋的热带水域。我国南海分布有玫瑰毒湁(Synanceia verrucosa),属于刺毒鱼中毒性最强的种类之一。石头鱼的背鳍、臀鳍和腹鳍分布有毒棘,背鳍棘两侧有毒囊,毒囊内含有具有较强的致死性和溶血活性的毒素。被石头鱼的毒棘刺伤后,可产生剧烈疼痛、低血压、水肿、恶心、头晕、胸闷等症状,严重者出现呼吸和循环衰竭,甚至死亡。国外每年有数百例石头鱼刺伤的报道,我国也已报道了多例石头鱼毒素中毒的病例,并有较严重的症状如蜂窝织炎、组织坏死等发生。目前,海蛇、海葵、水母以及石头鱼毒素等中毒已有抗血清研究报道,部分已用于临床。在石头鱼毒素的抗体制备方面,澳大利亚联邦血清实验室研制的石头鱼毒素抗毒血清,已用于石头鱼毒素中毒的治疗。新加坡YUEN等利用从Synanceja horrida中提取的毒素Stonustoxin(SNTX)免疫Balb/C小鼠,制备了8株单克隆抗体,具有较高的抗体亲和力和中和活性。由于国内尚无石头鱼毒素的抗毒血清,石头鱼毒素中毒的治疗主要是对症和支持治疗,如止痛、抗感染、抗休克和中医中药治疗等。因此制备一种有效的抗毒素用于石头鱼毒素治疗十分重要,发展其中毒的检测方法也很有必要。对于蛋白质类毒素的检测方法目前研究较少,主要包括生物测试法、质谱技术、蛋白质芯片技术、基因分析方法、免疫分析方法及胶体金试纸快速检测方法等。生物测试法是利用动物对毒素的敏感性来判断毒素的性质,比较常用的是小鼠生物测试法和大鼠生物测试法。蛋白质芯片技术属于高通量的蛋白质分析技术,可研究蛋白质与蛋白质之间的作用及蛋白质与核酸之间的相互作用,并可用于药物的蛋白靶点筛选。质谱分析技术的原理是将蛋白质经过蛋白酶消化后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图,与理论上相对应的质谱峰图进行比对而鉴定蛋白质,目前该方法已广泛应用于海洋多肽及蛋白毒素的鉴定或分析。酶联免疫分析方法是以抗原抗体的特异性反应为基础,利用酶对底物的催化作用来进行的一种高灵敏度的检测方法,具有高选择性、检测下限较低、操作简单等特点。主要包括免疫荧光法、放射免疫法及酶联免疫吸附试验等三类。酶联免疫吸附试验方法等,不仅可以用于对抗原的检测,也可以用于检测抗体。胶体金检测技术是利用胶体金的显色性和与蛋白结合且不改变其生物活性的能力,属于一项目快速检测技术,胶体金检测试纸条检测样品一般只需数分钟至几十分钟,操作简便,目前在医学、食品安全等领域具有十分广泛的应用。本实验室前期从石头鱼的毒棘中提取了石头鱼毒素粗毒液,并分离纯化了纯毒素neovtx,克隆了neovtx的α和β亚基的cdna序列,并在原核细胞中成功表达了α亚基。本研究在前期工作的基础上,开展neovtx大量制备,制备其鼠单抗及马抗,然后采用酶联免疫分析方法及胶体金技术分析血液中的neovtx,为石头鱼毒素的中毒诊断和治疗奠定基础。本论文主要结果如下:(1)制备了石头鱼毒素neovtx和具有很高抗毒活性的马抗利用aktaprime蛋白质纯化系统对石头鱼毒素粗毒液进行大量分离纯化,得到了neovtx纯毒素322.6mg,纯度达88.53%。分别用石头鱼毒素粗毒液和分离纯化的组分neovtx免疫balb/c小鼠得到了较高的抗体滴度,并将neovtx交由公司分别进行鼠单抗和马抗的制备。neovtx鼠单抗和马抗的sds-page或凝胶色谱鉴定表明抗体纯度较高(马抗纯度87.05%),鼠单抗(溶解于pbs至1mg/ml)的抗体滴度可达6400,马抗血清的抗体滴度最高可达409600(浓度为40mg/ml)。neovtx鼠单抗对neovtx毒素的中和活性较差,体外给予3ld50的neovtx与30倍质量的单抗(w/w)混合后静脉注射未发现具有保护活性。而马抗具有很好的保护活性,石头鱼粗毒液(4ld50):马抗=1:2体外混合20min静脉注射后小鼠可100%存活,neovtx(3ld50):马抗=1:3体外混合20min静脉注射后小鼠可100%存活。腹腔注射32ld50的neovtx30min后给予3倍质量的马抗尾静脉注射,小鼠全部存活。(2)酶联免疫分析方法可灵敏检测血液中的neovtx首先利用简易过碘酸钠法将neovtx马抗与辣根过氧化物酶(hrp)偶联,得到马抗-hrp偶联物。通过逐步试验探索最佳的实验条件,测定了马抗的最佳包被浓度、马抗-hrp最佳浓度,建立了pbs溶液中的双抗体夹心elisa检测方法及标准曲线。该方法在pbs溶液中的线性回归方程为y=1.676x-1.140(r2=0.9728,n=8,p0.0001),线性范围为4-512ng/ml。但人血浆中neovtx样品的od值显著低于同等浓度neovtx在pbs溶液中的od值,其在人血浆中的检测标准曲线的线性回归方程为y=0.3094x-0.1208(r2=0.9907,n=10,p0.0001),线性范围为4-2048ng/ml。该方法灵敏度高,在pbs和血浆中检测灵敏度均可达4ng/ml,并具有较好的特异性和重复性。(3)建立了neovtx的胶体金检测方法以氯金酸为原料,利用柠檬酸三钠还原法制备了6种不同粒径的胶体金溶液,利用紫外可见光分光光度计及电镜法证实胶体金制备成功。通过实验确定胶体金标记的最佳pH值为8.0,1 ml胶体金溶液的最佳马抗标记量为96μg,利用胶体金与石头鱼毒素马抗结合,制备了金标马抗,经初步实验验证金标马抗制备成功。在此基础上,通过实验确定了合适的胶体金层析材料:NC膜选择Millipore135型,胶体金垫选择GL 0194型,样品垫选择GL-b01型,吸水滤纸为H 5076型。各条带的最佳点样浓度分别为:C线为羊抗马IgG稀释45倍,T线浓度为马抗稀释至4 mg/ml,胶体金垫最佳浓度为金标马抗液稀释2倍后每垫滴加15μl。通过不断优化实验条件,成功制备了石头鱼毒素胶体金检测试纸。该检测试纸条灵敏度较高,检测限可达100 ng/ml左右,该试纸条特异性较强,对BSA、卵清蛋白及水母毒素等无非特异性反应出现。
[Abstract]:A variety of marine organisms capable of secreting proteins such as sea anemones , jellyfish , etc . , soft body doors ( such as sea star , sea rabbit , etc . ) , toxic fish ( such as sea star , sea urchins , etc . ) , toxic fish ( such as sea star , sea urchins , etc . ) , toxic fish ( such as sea star , sea snake , etc . ) , toxic fish ( such as poison fish and poisonous gland fish ) and sea snake have been reported . This paper deals with the determination of toxin by using the method of enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) , radioimmunoassay and enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ) . The results showed that the optimum pH value of the colloidal gold was 8.0 , the optimal concentration of horse anti - hrp was 4 - 512ng / ml .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R996.3

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