上皮钠通道在糖皮质激素致骨骼肌萎缩中的作用研究

发布时间：2018-04-29 22:19

本文选题：近交系和封闭群Wistar大鼠 + 糖皮质激素性骨骼肌萎缩(GIMA)　；参考：《广东药科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的建立近交系和封闭群Wistar大鼠糖皮质激素性骨骼肌萎缩(Glucocorticoid induced skeletal muscle atrophy,GIMA)模型并比较两种品系大鼠GIMA模型的差异。观察GIMA模型大鼠腓肠肌组织糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor,GR)、α-上皮钠离子通道(α-Epithelial sodium channel,α-ENaC)和肌萎缩盒F基因(muscle atrophy F-box,MAFbx)mRNA含量的变化,从整体动物水平探究ENaC在GIMA发病中的作用。观察体外培养成肌细胞C2C12在地塞米松(dexamethasone,Dex)和ENaC特异性阻断剂——阿米洛利(Amilorid,Ami)干预下增殖和分化变化,从细胞水平探究ENaC功能变化对GC影响骨骼肌细胞再生的可能作用。方法近交系和封闭群Wistar大鼠各32只分别随机分为4组给药:对照组(C组)肌注生理盐水1.0 mg/kg,每周3次;低频组(L组)、中频组(M组)和高频组(H组)分别每周1、3、5次肌注Dex 1.0 mg/kg,给药90天。取大鼠右侧腓肠肌进行石蜡切片和HE染色,检视肌纤维的形态及横截面积变化;取左侧腓肠肌进行冰冻切片和肌纤维分型染色,观察Ⅰ、Ⅱ两型纤维变化,并提取总RNA进行RT-PCR及q-PCR检测GR、α-ENaC和MAFbx基因mRNA含量变化。用CCK-8法及肌管直径测量法分别检测不同浓度Dex(5×10-7M~1.5×10-4M)和Ami(10-5M)单独及联合用药对体外培养小鼠成肌细胞C2C12增殖和分化的影响。结果(1)两种品系大鼠M和H组体重较C组、L组显著减少(P0.01)。(2)两种品系大鼠H组腓肠肌系数较C组(P0.01)、L组均显著降低(P0.05)。(3)近交系大鼠M组和H组肌纤维横截面积均较C组、L组显著减少(P0.01)。封闭群大鼠各用药组随用药频率增加肌纤维横截面积显著减少(P0.01)。(4)随用药频率增加,两种品系大鼠各用药组Ⅱ型纤维横截面积均较C组显著减少(P0.01),其中,近交系的变化呈频率依赖性。(5)近交系大鼠各用药组GR、α-ENaC和MAFbx基因m RNA含量均较C组有同步增加趋势,其中,H组α-ENaC基因mRNA含量比C组、L组显著增加(P0.01);封闭群大鼠各用药组MAFbx基因mRNA含量均比C组显著增加(P0.05);M组和H组α-ENaC mRNA含量较C组(P0.05)、L组(P0.01)显著增加,但M组和H组GR mRNA含量较C组(P0.05)、L组(P0.01)显著减少。(6)Dex作用于C2C12细胞,24h时,在5×10-4M以下能显著促进细胞增殖(P0.05),而提升至1.5×10-4M则有抑制细胞增殖趋势,但48h时,各浓度下均显著抑制细胞增殖(P0.05)。10-5M Ami作用C2C12细胞,24h时,对细胞增殖有显著促进(P0.05),当延至48h则增殖未见显著变化。10-5M Ami与Dex联合作用C2C12细胞,24h时,在Dex5×10-4M以下有促进细胞增殖的趋势,但增至1.5×10-4M则抑制细胞增殖;48h时,Dex各浓度下都有抑制细胞增殖的趋势,且较单用Ami时更显著抑制(P0.05)。(7)10-5M Ami及各浓度Dex单用或联合作用于分化期C2C12细胞72h,细胞肌管直径均显著减少(P0.05),但未见浓度依赖性。结论以Dex 1.0 mg/kg每周3、5次肌注均可成功诱导两种品系大鼠建立GIMA模型,近交系模型较封闭群模型更具骨骼肌萎缩典型病变及GC的量-效效应。GC用药可使两种品系GIMA大鼠骨骼肌组织α-ENaC和MAFbx基因m RNA含量增加,同时,近交系模型的GR基因表达增加呈浓度依赖性趋势,且与α-ENaC和MAFbx基因表达同步增加,显示了近交系模型骨骼肌肌纤维对GC作为信号分子所诱导信号转导机制有较为一致的群体响应,体现出近交系动物在基因背景研究中的优势,也提示了骨骼肌肌纤维GR介导外源性GC诱导骨骼肌ENaC基因和萎缩基因高表达可能与GIMA的发生相关。此外,以不同用药频率和时长的Dex及Ami干预体外培养成肌细胞C2C12的增殖和肌管直径变化结果显示,GC对成肌细胞增殖可能有双向调节作用,即低浓度、短期用药促进细胞增殖而高浓度、长期用药抑制细胞增殖,并抑制成肌细胞分化。当ENaC功能受短期抑制后可促进成肌细胞增殖,但对成肌细胞分化均表现抑制,且在GC作用下,Ami对细胞增殖和分化的抑制更显著,提示骨骼肌肌纤维ENaC可能参与了成肌细胞的增殖和分化调控,ENaC功能正常有助于成肌细胞的分化,对GIMA的骨骼肌肌纤维再生修复有正面影响。
[Abstract]:Objective To investigate the effects of ENaC on the proliferation and differentiation of rat myoblasts by means of CCK - 8 method and muscle fiber typing . Results ( 1 ) All 32 Wistar rats were randomly divided into 4 groups : control group ( group C ) , group C ( group M ) and high frequency group ( H group ) . ( 4 ) Compared with group C ( P0.05 ) , the mRNA content of 伪 - ENaC mRNA was significantly increased in group M and H group ( P0.05 ) . The results showed that the effect of GC on the proliferation and differentiation of muscle cells induced by GC as a signal molecule showed that the proliferation and differentiation of myoblasts were inhibited by GC . The effect of GC on the proliferation and differentiation of myoblasts was shown . The results suggested that the skeletal muscle fibers could be involved in the proliferation and differentiation of myoblasts .

【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

【参考文献】