PCM和TAT双修饰脂质体心肌靶向传递系统的研究

发布时间：2018-05-04 14:25

本文选题：心肌靶向 + PCM　；参考：《重庆医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：缺血性心脏病(Ischemic heart disease,IHD)是一类冠状动脉疾病,它是世界范围内最常见的死亡原因之一。国内外公认的传统疗法有药物治疗、介入治疗和外科手术治疗三种,其中药物治疗安全有效,但许多治疗药物不能有效浓集于心肌,所以探索新的更具靶向性的药物载体已经成为该领域的研究趋势。脂质体是最常用的靶向给药系统之一,通过配体修饰脂质体表面,脂质体可经受体或电荷介导的内吞作用进入细胞,可有效地提高靶向效率,精确地靶向靶细胞或靶组织,从而提高生物利用度,减少副作用。PCM(WLSEAGPVVTVRALRGTGSW)是通过噬菌体展示技术筛选出的由20个氨基酸组成的肽段,是一种心肌细胞特异性靶向肽。TAT是近年来广泛应用于修饰药物和药物载体的一种细胞穿膜肽,它由11个氨基酸(YGRKKRRQRRR)组成,可将与之相连的药物或药物载体以一种浓度依赖的方式高效、快速地导入细胞内。本文制备了PCM和TAT修饰的脂质体,以香豆素-6和EGFP质粒分别作为传统药物和基因药物的模型药物。通过体外和体内实验研究了载香豆素-6的PCM和TAT双修饰脂质体的心肌靶向性,结果表明,PCM和TAT双修饰的脂质体具有良好的心肌靶向性。通过体外实验初步研究了载EGFP质粒的PCM修饰的脂质体的心肌转染效率,结果表明,PCM修饰的脂质体具有良好的心肌细胞转染效率。本文设计并构建了PCM和TAT双修饰的脂质体,用以提高脂质体向心肌的传递能力。第一部分对载香豆素-6的PCM和TAT双修饰的脂质体的制备工艺和处方进行了筛选。首先采用操作简单,制备工艺稳定的薄膜分散-超声法制备脂质体,再利用PCM-Cys和TAT-Cys中半胱氨酸的巯基与DSPE-PEG2000-MAL中马来酰亚胺的双键发生加成反应,将多肽连接于脂质体表面。以包封率为指标,筛选了香豆素-6的最佳用量及PCM和TAT的连接方式。通过研究H9C2细胞对不同脂质体的摄取率,筛选出PCM的最佳用量为脂质的3%,TAT的最佳用量为脂质的1%。筛选得到的双修饰脂质体形态圆整,粒径在115nm左右。第二部分对载香豆素-6的PCM和TAT双修饰脂质体进行了体外评价,初步验证了双修饰脂质体的心肌靶向性。制备了载香豆素-6和未载香豆素-6的未修饰的普通脂质体Lip,3%PCM修饰的脂质体3%P-Lip,1%TAT修饰的脂质体1%T-Lip以及1%PCM和1%TAT双修饰的脂质体3%P-1%T-Lip。通过CCK-8试验测定了各种未载香豆素-6的脂质体的毒性,结果表明脂质体用量小于等于0.4 m M时,各种脂质体无明显毒性。通过共聚焦显微镜和流式细胞术定性和定量地研究了原代心肌细胞对不同脂质体的摄取,结果各种脂质体的细胞摄取率:3%P-1%T-Lip3%P-Lip1%T-LipLip。同时还研究了游离多肽PCM和TAT对脂质体摄取的影响,结果游离PCM抑制PCM修饰脂质体的摄取,而游离TAT对TAT修饰脂质体的摄取无明显抑制。第三部分对载香豆素-6的PCM和TAT双修饰脂质体进行了体内评价,进一步验证了双修饰脂质体的心肌靶向性。首先对尾静脉给予了载香豆素-6的各种脂质体的昆明小鼠心脏组织冰冻切片进行定性观察,然后对尾静脉给予载香豆素-6的各种脂质体后香豆素-6在各脏器内的含量采用HPLC-FLD法进行定量测定。定性观察和定量测定结果显示各种脂质体的心脏蓄积量:3%P-1%T-Lip3%P-Lip1%TLipLip,说明双修饰脂质体具有较好的心肌靶向性。3%P-1%T-Lip,3%P-Lip,1%T-Lip和Lip在肝、脾、肺、肾等器官也有一定的分布,但3%P-1%T-Lip与对照组相比心肌蓄积量明显增加,而在肝、脾、肾、肺的分布没有明显增高。第四部分对载增强绿色荧光蛋白表达质粒(p EGFP)的PCM修饰脂质体的制备工艺和体外靶向性进行了研究,拟用于提高载基因治疗药物的脂质体的心肌传递能力。此部分增加DOTAP为阳离子脂质材料,采用薄膜分散-超声法制备脂质体,再将DSPE-PEG2000-PCM制成胶束插入脂质体。制备了未修饰的普通脂质体LIP,1%PCM修饰的脂质体1%P-LIP,3%PCM修饰的脂质体3%P-LIP和5%PCM修饰的脂质体5%P-LIP。通过测定PCM的连接率筛选了PCM的连接方法,通过琼脂糖凝胶电泳考察了脂质体的载药能力。通过定性观察和定量测定考察了不同量PCM修饰脂质体对心肌细胞的转染效果,筛选了PCM的最佳用量为3%。制备得到的载p EGFP的LIP和3%P-LIP的粒径分别为212.4±2.95nm和261.9±2.20nm,连接PCM后脂质体粒径增大。综上所述,本课题成功制备了载香豆素-6的PCM和TAT双修饰脂质体,经体内外实验研究表明该系统是具有潜力的心脏疾病药物传递系统。还制备了载pEGFP的PCM单修饰的脂质体,体外实验初步证明PCM修饰的脂质体具有一定的心肌靶向性,但该系统还待进一步验证其体内靶向性。
[Abstract]:In vitro and in vivo experiments have been carried out in vitro and in vivo to study the myocardial targeting properties of PCM and TAT double modified liposomes . A modified liposome was prepared by means of qualitative observation and quantitative determination . The results showed that the size of liposome was 212 . 4 卤 2 . 95nm and 261 . 9 卤 2 . 20 nm .

【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R943

【参考文献】