去整合素金属蛋白酶ADAM12相互作用蛋白鉴定及功能研究

发布时间：2018-05-05 02:39

  本文选题：ADAM12-L + ADAM12-S　； 参考：《苏州大学》2016年硕士论文

【摘要】：研究背景和目的:去整合素金属蛋白酶(ADAMs,A Disintegrin And Metalloproteinases)家族是一类含有前肽结构域、金属蛋白酶结构域、去整合素结构域、富半胱氨酸结构域、膜近端上皮生长因子样结构域等多个结构域的锌离子依赖的跨膜糖蛋白水解酶,它们参与多种生物学过程,包括蛋白水解、信号转导、细胞粘连、迁移等,并与肿瘤的发生和侵袭密切相关。人源ADAM12定位于染色体10q26.3,具有典型的ADAM家族蛋白的结构序列。现有临床研究发现ADAM12在多种肿瘤细胞中高表达。目前已发现该水解酶可以水解一些特定的底物蛋白,如Heparin-binding EGF-like growth factor(HB-EGF)、Delta-like 1、Ephrin-A1等。用小分子药物抑制其水解活性,可以抑制HB-EGF的脱落,使心肌肥大症状减缓,这说明了ADAM12的水解功能在疾病发生发展过程中的重要性。但ADAM12是如何调节下游蛋白来实现其功能、促进肿瘤细胞的增殖和转移等问题还不清楚。本论文中,我们以ADAM12为研究对象,通过液质联用质谱仪高通量筛选在肿瘤细胞中与ADAM12相互作用的蛋白,并探究这些蛋白与ADAM12的相互调控关系。研究方法:首先构建了带FLAG标签的ADAM12的两个亚型ADAM12-L和ADAM12-S的质粒。在人宫颈癌细胞HeLa细胞中过表达ADAM12-L和ADAM12-S并收集细胞提取蛋白,然后用与共价结合FLAG抗体的微珠进行免疫共沉淀,纯化富集并洗脱与ADAM12-L和/或ADAM12-S相互作用的蛋白,再通过蛋白免疫印迹方法验证蛋白表达及纯化效率。将纯化后的蛋白用SDS-PAGE分离并银染,找到实验组与对照组有差异的条带,胶内用胰蛋白酶酶解成多肽后,用LC-MS/MS质谱分析,通过数据库搜索获得与ADAM12-L和/或ADAM12-S相互作用的蛋白。通过生物信息学方法分析这些蛋白的已知功能,预测ADAM12可能参与的生物学过程及其生物学功能。最后通过生物化学方法验证这些蛋白与ADAM12-L和/或ADAM12-S的相互作用并探究其在肿瘤细胞中与ADAM12-L和/或ADAM12-S的相互调控关系。研究结果:在两次生物学重复实验中,通过质谱分析我们共发现了297个与ADAM12-L相互作用的蛋白,其中有33个蛋白在两次实验中均存在;同时,共发现149个与ADAM12-S相互作用的蛋白,其中的13个蛋白在两次生物学重复中均被发现,在这13个蛋白里,有11个与ADAM12-S特异性相互作用。ADAM12的不同亚型有其特异性相互作用的蛋白,预示着它们不同的功能。生物化学方法验证了myoferlin、vimentin和endoplasmin(GRP94)与ADAM12-L或ADAM12-S的相互作用。许多与ADAM12相互作用的蛋白与肿瘤细胞的增殖和转移相关。另外,过表达实验发现ADAM12-L可以上调其相互作用蛋白vimentin的表达,且无酶活性的突变体ADAM12-L-E351Q也可以上调vimentin蛋白的表达,程度与野生型ADAM12-L接近。而myoferlin则可以通过影响ADAM12-L的稳定性,上调未成熟型的ADAM12-L的表达并使其降解速度明显变缓,但对成熟型的ADAM12-L影响不大;当通过siRNA敲低myoferlin后,两种形式的ADAM12-L的表达都有所减少。分子伴侣GRP94则对ADAM12-S的分泌有着重要的调节作用,用siRNA敲低GRP94使其蛋白表达水平降低后,发现分泌到培养基中的ADAM12-S明显减少。研究结论:通过无标记定量蛋白质组学技术高通量筛选获得297个ADAM12-L相互作用的蛋白,149个与ADAM12-S相互作用的蛋白,并通过免疫印迹的方法验证其中的一些蛋白,同时发现它们与ADAM12-L或ADAM12-S之间的相互调控关系。我们的实验发现ADAM12-L很有可能是连接肿瘤细胞中高表达的蛋白myoferlin和vimentin的关键蛋白,同时也揭示了ADAM12-L的非酶活性功能。这些发现对我们研究ADAM12-L在肿瘤细胞中参与的信号通路,揭示其调控肿瘤细胞增殖、转移和侵袭的分子机制等有很大的帮助。GRP94可以调节ADAM12-S从细胞分泌到细胞外,ADAM12-S的分泌降解细胞外基质,与其促进肿瘤细胞转移和侵袭密切相关,这可以帮助我们揭示ADAM12-S使肿瘤细胞侵袭力增加的分子机制。
[Abstract]:In this paper , we have found that the proteolytic enzyme can hydrolyze some specific substrate proteins , such as heparin - binding EGF - like growth factor ( HB - EGF ) , Delta - like 1 , Ephrin - A1 , etc . In addition , it has been found that the expression of vimentin can be regulated by means of high throughput screening . In addition , it is possible to increase the expression of vimentin by means of high throughput screening .

【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96

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