左氧氟沙星在GES-1细胞和MGC80-3细胞上的转运特征

发布时间：2018-05-05 18:04

  本文选题：GES-1细胞 + MGC80-3细胞　； 参考：《安徽医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的 研究左氧氟沙星在GES-1及MGC80-3细胞上的跨膜转运特征及可能存在的转运体，初步探讨药物浓度、药物孵育时间、温度、细胞外pH值和转运体抑制剂环孢素A、维拉帕米、西咪替丁对药物转运量的影响。 方法 （1）将GES-1、MGC80-3细胞与含有100、200μmol·L-1的左氧氟沙星的Hanks液共孵育1、5、7.5、10、15、30、60min后收集细胞、比较不同时间，不同浓度对左氧氟沙星在两种细胞上转运的影响。 （2）将GES-1、MGC80-3细胞与不同pH值及不同温度的含100μmol·L-1左氧氟沙星的Hanks液共孵育30min后收集细胞，比较不同温度，不同pH值对左氧氟沙星在两种细胞上转运的影响。 （3）将GES-1、MGC80-3细胞与含有100μmol·L-1左氧氟沙星的Hanks液及P-糖蛋白转运抑制剂环孢素A、维拉帕米和有机阳离子转运体抑制剂西咪替丁共同孵育1、5、7.5、10、15、30min后收集细胞，比较转运体抑制剂对左氧氟沙星在两种细胞转运上的影响。 （4）收集细胞样本后经反复冻融3次和超声破碎细胞，采用高效液相色谱法（HPLC）测定胞内药物含量，考马斯亮蓝法定量细胞蛋白总量。用细胞内药物含量与细胞总蛋白量的比值作为观察药物转运量的检测指标。 （5）建立GES-1和MGC80-3细胞内左氧氟沙星检测的HPLC方法：细胞裂解样本经冷冻离心机12000rpm·min-1离心15min，取上清加等体积甲醇沉淀蛋白，再次取上清并经微孔滤膜过滤，用于测定左氧氟沙星浓度，HPLC条件：流动相为乙腈-50mmol·L-1柠檬酸溶液-1mol·L-1醋酸铵溶液(17:82:1；v/v/v)，Welch C18分析柱，流速1.0ml·min-1，紫外检测波长295nm，柱温40℃，进样量20μl。评价专属性、线性、准确度、精密度、稳定性和灵敏度。 结果 （1）GES-1和MGC80-3细胞的药物转运量，1-5min时明显增加，7.5-15min缓慢增加并达到稳态。100μmol·L-1左氧氟沙星孵育1、30min时GES-1胞内药物转运量分别是0.945±0.030μg/mg、1.198±0.086μg/mg。100μmol·L-1左氧氟沙星孵育1、30min时MGC80-3胞内转运量分别是0.734±0.025μg/mg、1.007±0.041μg/mg。 （2）GES-1和MGC80-3细胞的药物转运量，，胞外左氧氟沙星浓度为200μmol·L-1时明显大于100μmol·L-1(P0.05)。100μmol·L-1、200μmol·L-1左氧氟沙星孵育30min时GES-1胞内药物转运量分别是1.198±0.086μg/mg、1.618±0.215μg/mg。100μmol·L-1、200μmol·L-1左氧氟沙星孵育30min时MGC80-3胞内药物转运量分别是1.007±0.041μg/mg、1.414±0.052μg/mg。 （3）GES-1和MGC80-3细胞的药物转运量，孵育温度为37℃时最大，37℃大于25℃(P0.05)，但明显大于4℃(P0.01)。100μmol·L-1左氧氟沙星置于37℃、25℃、4℃孵育30min时GES-1胞内药物转运量分别是1.173±0.057μg/mg、1.024±0.080μg/mg、0.642±0.099μg/mg。100μmol·L-1左氧氟沙星置于37℃、25℃、4℃孵育30min时MGC80-3胞内药物转运量分别是1.001±0.072μg/mg、0.846±0.056μg/mg、0.599±0.048μg/mg。 （4）GES-1和MGC80-3细胞的药物转运量，pH值为7.4时最大，pH7.4大于pH6.4和pH8.4(P0.05)，但明显大于pH值为5.4时(P0.01)。100μmol·L-1左氧氟沙星在pH5.4、pH6.4、pH7.4、pH8.4下孵育30min时GES-1胞内药物转运量分别是0.822±0.047μg/mg、1.078±0.076μg/mg、1.209±0.047μg/mg、1.090±0.070μg/mg。100μmol·L-1左氧氟沙星在pH5.4、pH6.4、pH7.4、pH8.4下孵育30min时MGC80-3细胞内药物转运量分别是0.724±0.036μg/mg、0.913±0.061μg/mg、1.040±0.094μg/mg、0.902±0.091μg/mg。 （5）P-糖蛋白抑制剂（环孢素A、维拉帕米）作用组，GES-1和MGC80-3细胞上的药物转运量相近。100μmol·L-1左氧氟沙星+10μmol·L-1环孢素A孵育GES-1和MGC80-3细胞30min，胞内药物转运量分别是1.311±0.0850μg/mg、1.363±0.072μg/mg。各个时间点下，两种细胞药物转运量都较对照组增加，GES-1细胞的药物转运量较对照组增加约2.07%-13.23%（P0.05)，MGC80-3细胞的药物转运量较对照组增加约17.51%-35.30%(P0.05)。在有机阳离子转运体抑制剂（西咪替丁）作用下两种细胞药物转运量较对照组无明显改变。 结论 （1）左氧氟沙星在GES-1细胞和MGC80-3细胞上存在跨膜转运，转运有明显的浓度、时间、温度、pH值依赖性。P-糖蛋白可能参与左氧氟沙星在GES-1细胞上的转运，P-糖蛋白参与了左氧氟沙星在MGC80-3细胞上的转运。有机阳离子转运体不参与左氧氟沙星在GES-1和MGC80-3细胞上的转运。 （2）本实验应用的检测左氧氟沙星的高效液相色谱法方法，具有分离度好、准确度、精密度、稳定性、灵敏度高的特点，可以用于检测GES-1和MGC80-3细胞内左氧氟沙星含量。
[Abstract]:Purpose

The trans - membrane transport characteristics of levofloxacin on GES - 1 and MGC80 - 3 cells and possible transporter were studied . The effects of drug concentration , drug incubation time , temperature , extracellular pH value , and trans - transporter inhibitor cyclosporin A , verapamil and simitedin on drug delivery were investigated .

method

( 1 ) GES - 1 , MGC80 - 3 cells were incubated with Hanks containing 100 , 200 渭mol 路 L - 1 levofloxacin for 1 , 5 , 7.5 , 10 , 15 , 30 and 60 min .

( 2 ) After incubation of GES - 1 , MGC80 - 3 cells with Hanks solution containing 100 渭mol 路 L - 1 levofloxacin at different pH and different temperatures for 30 min , the cells were collected , and the effects of different temperature and different pH values on the transport of levofloxacin on both cells were compared .

( 3 ) GES - 1 , MGC80 - 3 cells were incubated with Hanks solution containing 100 渭mol 路 L - 1 levofloxacin , P - glycoprotein transport inhibitor cyclosporin A , verapamil and organic cation transporter inhibitor simitedin for 1 , 5 , 7.5 , 10 , 15 , 30 min .

( 4 ) After collecting the cell samples , repeatedly freezing and thawing three times and ultrasonic breaking cells , the intracellular drug content is determined by high performance liquid chromatography ( HPLC ) , and the total amount of the cell protein is detected by the method of high performance liquid chromatography ( HPLC ) , and the ratio of the drug content in the cell and the total amount of the total protein of the cell is used as the detection index for observing the drug delivery amount .

( 5 ) HPLC method for detection of levofloxacin in GES - 1 and MGC80 - 3 cells was established : cell lysis samples were centrifuged at 12000 rpm 路 min - 1 for 15 min , the supernatant was collected and filtered through a microporous filter membrane to determine the concentration of levofloxacin , and the HPLC conditions were as follows : acetonitrile - 50 mmol 路 L - 1 citric acid solution - 1 mol 路 L - 1 ammonium acetate solution ( 17 : 82 : 1 ;
The specificity , linearity , accuracy , precision , stability and sensitivity were evaluated .

Results

( 1 ) The transport amount of GES - 1 and MGC80 - 3 cells increased significantly at 1 - 5 min , and the amount of intracellular drug transport was 0.945 卤 0.030 渭g / mg , 1.198 卤 0.086 渭g / mg and 1.198 卤 0.086 渭g / mg , 1.007 卤 0.041 渭g / mg respectively .

( 2 ) The drug transport capacity of GES - 1 and MGC80 - 3 cells was 1.198 卤 0.086 渭g / mg , 1.618 卤 0.215 渭g / mg and 1.618 卤 0.215 渭g / mg 路 L -1 for 30 min , respectively .

( 3 ) The drug transport capacity of GES - 1 and MGC80 - 3 cells was maximum at 37 鈩

本文编号：1848742