靶向DRG给药新模型的建立以及DRG中GABA系统在外周疼痛中的作用

发布时间：2018-05-06 09:02

本文选题：DRG + GABA　；参考：《河北医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：外周神经司职将机体环境中各种信息传递到大脑,包括来自皮肤的触觉和温度,空气中的化学成分,四肢和关节的相关位置等。其中外周神经的重要功能之一是疼痛感觉的形成和传递,即向中枢告知正在发生的或者即将出现的身体损伤。人们目前普遍的认为是1)外周痛觉信号自冲动形成部位(如皮肤、内脏及关节肌肉等部位)通过传入纤维向中枢的传递是没有间断的连续传递过程,期间没有突触形成、也不受其他神经的突触调节;2)存在于外周感觉神经节部位如背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)的神经元胞体在正常情况下对痛觉冲动的传导几乎没有影响;只有在病理情况下DRG胞体的异常兴奋才可能参与病理性疼痛的发生。背根神经节(DRG)神经元是脊髓躯体感觉系统中初级神经元。DRG神经元属于假单极神经元,胞体分出一根轴突后在离胞体不远处形成T形分支,其中一支上行脊髓形成中枢端,另一支下行躯体形成外周端。目前大多数的研究集中于躯体感觉信号沿着DRG神经纤维的传导过程,然而对DRG胞体在外周躯体感觉,特别是伤害性感觉即痛觉感受中的作用一直未引起人们足够的重视。难道DRG神经元胞体只是作为轴突输送营养代谢物质的“工厂”?它在痛觉信号传递过程中有无特定的功能?已知DRG表达多种经典的神经递质受体的亚型,例如5-羟色胺,谷氨酸以及γ-氨基丁酸(GABA)受体。GABAA受体在痛觉信号传递过程中有着重要的作用。GABA在成年哺乳动物的中枢神经系统中是重要的抑制性神经递质,主要通过选择性阴离子通道GABAA受体引起膜超极化而发挥抑制性作用。然而与中枢神经系统不同,GABAA受体在初级传入神经元的激活则可能导致去极化;DRG神经元中枢突末端由GABAA受体兴奋导致的去极化在痛觉信号传递过程中发挥重要的作用。人们将此去极化作用称为PAD(primary afferent depolarization),其通过突触前抑制作用减少外周传入动作电位幅度和兴奋性,从而使得突触前膜神经递质释放减少,最终抑制痛觉信号的传递。关于在胞体富集的DRG是否存在GABA环路(circuit)系统,以及此系统在痛觉信号传递和调节中又有何作用呢?环路(circuit)系统,以及此系统在痛觉信号传递和调节中又有何作用呢?目前尚不清楚,本研究将试图对上述科学问题进行探讨。为回答上述问题,我们首先建立了一种DRG局部给药的方法,通过大鼠背部植入的沟通DRG的套管,将药物靶向递送到DRG,由此提供了观察药物对DRG局部作用的精确方法,为研究DRG胞体在外周痛觉传递中的作用奠定了基础。其次,我们在研究中确定了 DRG存在功能性GABA环路系统的基本条件,它对疼痛信号传导可起到信号的调控和整合作用。第一部分靶向DRG给药新模型的成功建立目的:建立一种全新的模型,能够将药物靶向递送到DRG。并通过完善不同的对照实验,以确认药物输送的可靠性,特别是确定药物没有扩散到脊髓。方法:1手术过程:大鼠深度麻醉下,在L4-L6脊柱之间做一个切口并确认L5。通过椎板钻孔到达L5DRG。当后爪抽动时钻孔立即停止,确定接近了 DRG。将一个不锈钢钝头套管插入孔中,并且连接上套管帽。切口和套管用牙科水泥牢牢地固定。大鼠恢复后,植入的套管用于药物(3-5μl总体积)对DRG局部的应用。2DRG及脊髓切片:动物处死,快速提取出L5DRG以及近端的部分腰髓,浸泡在组织胶内,冻存。使用冰冻切片机将组织切成15μm的切片。3应用激光共聚焦技术、高效液相荧光检测(HPLC-FLD)系统验证药物输送位置;利用整体行为学研究此方法注射的药物对缓激肽诱导的急性炎性痛的作用。结果:(1)通过 DRG 套管注射荧光染料 5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester(20μM,5μl)后,激光共聚焦证明DRG充满丰富的染色,然而在脊髓完全没有着色。(2)GABA(200μM,5μl)通过套管递送到DRG,高效液相荧光检测出DRG部位GABA水平明显增高(注射GABA组15594.6±3230.75,n=5;空白对照组6340.4±1458.70,n=5,P0.05)。而脊髓没有变化。(3)炎性疼痛行为学结果表明Kv7通道的激动剂,KATP通道的开放剂以及HCN通道阻断剂通过DRG套管注射后可以降低由缓激肽诱导的炎性痛。Bradykinin(BK,200μM,50μl)注射到后脚掌会导致强烈的疼痛行为,反应时间为(122±9.7s,n=21)。然而 Saline(5μl)或者 DMSO(5μl)通过DRG套管注射不会对BK诱导的疼痛产生有效的作用(时间分别为119± 16.9s,n=8;120±15.7s,n=5)。RTG为Kv7通道激动剂,通过套管注射RTG(200μM,5μl)能显著降低BK诱导的疼痛(63±10.9s,n=8,P0.01)。Pinacidil(PIN)为 KATP 的激动剂,套管注射 PIN(200μM,5μl)减少了疼痛反应时间(66±23.0s,n=5,P0.01)。我们同时也应用了 ZD7288(ZD,200μM,5μl),疼痛反应的时间减少到(76±8.7s,n=11,P0.01)。但是当BK注射到对侧的脚掌时,RTG不能降低BK诱导的疼痛(contralateral RTG组:129±11.7s,n=6;contralateral Saline 组:148±16.1s,n=6)结论:我们的结果表明DRG套管技术提供了精确的靶向DRG给药的方法。此外,我们的数据说明DRG局部给药可显著降低外周疼痛,提示DRG神经元胞体在痛觉信号传递中有不可忽视的调控作用。预示DRG可作为外周慢性疼痛的治疗靶点。第二部分DRG GABA系统在外周疼痛中的重要作用目的:建立DRG套管植入模型,以及缓激肽(BK)诱导的炎性疼痛模型,观察DRG GABA系统对外周疼痛的影响以及GABA对DRG神经元兴奋性的作用。方法:大鼠DRG套管植入模型以及缓激肽诱导的炎性疼痛模型;全细胞膜片钳技术结果:(1)电生理结果1.2 GABA对小DRG神经元的兴奋性有抑制作用。我们在小DRG神经元上研究GABA(200μM)对动作电位(AP)爆发的影响。给予一个缓慢去极化斜坡电流(0到800pA),爆发出AP。在大多数神经元(28/38),GABA的应用导致AP停止(11/38,7.3±1.4 AP变为0)或者减少(17/38,14.8±2.2 AP减少到9.5±2.0AP)。很小比例的神经元GABA没作用(5/38)或者稍微增加了 AP(5/38,12.8±4.5 AP增加到15.6±6.2 AP)。5个没有作用的除外,其它所有小DRG神经元GABA诱导显著的膜电位去极化(AP 停止的神经元:从-55.6± 1.8mV 到-45.5±2.8mV,n=11,P0.001;AP 减少的神经元:从-57.4±1.7mV 到-45.7±2.0mV,n=17,P0.001;AP增加的神经元:从-57.2±4.8mV 到-37.1±1.9mV,n=5,P0.05)。同时 GABA也降低了第一个AP的振幅(AP减少的神经元:从46.8±3.3mV降到33.9±7.7mV,n=17,P0.01)。AP 减少的神经元增加了 Reobase(从128.9±26.9pA 增加到 197.5±44.2pA,n=17,P0.05)。(2)炎性疼痛行为学结果DRG局部给予GABA减少大鼠疼痛行为。GABA(200μM,5μl)减少了 BK(200μM,50μl)诱导的伤害性疼痛行为(14±2.8s,n=7;BK+Vehicle组:77±7.9s,n=7,P0.01)。Muscimol(GABAA受体激动剂,200μM,5μl)套管注射也有同样的效果(21 ±4.7s,n=7,P0.01;BK+Vehicle组:80±5.3s,n=7)。重要的是,当BK注射到对侧的脚掌时,无论是GABA还是Muscimol都不能降低BK诱导的疼痛。(contralateral GABA组:71±7.7s,n=4;contralateral Muscimol 组:69±14.0s,n=4),这表明 DRG套管注射的药物没有扩散到脊髓。然而Saline脚掌注射不会引发疼痛(7±2.8s,n=4)。最有趣的发现是 Bicuculline(GABAA antagonist,200μM,5μl)的作用。不仅加重 BK 诱导的疼痛(214± 18.8s,n=6,P0.001;BK+Vehicle组:98± 13.9s,n=6),而且在没有BK注射的前提下,Bicucculline套管注射会导致同侧脚掌明显的抬脚和舔脚的行为(79±9.0s,n=6,P0.01;Vehicle 组:21±13.0s,n=6)。我们也测试了 GAT1阻断剂的作用。GAT1抑制剂NO711(200μM,5μl)应用到DRG明显减少了 BK诱导的疼痛(41±4.8s,n=6,P0.05;BK+Vehicle 组:74±11.2s,n=5)。这表明 GAT1 阻断会导致 DRG 中 GABA释放的增加。有意思的是,无论 GABA(200μM,50μl)还是 Bicuculline(200μM,50μl)注射到脚掌都不会产生疼痛(GABA组:35±6.5s,n=5;Vehicle组:14±3.8s,n=5;BK 组:164±23.2s,n=5)(Bicuculline 组:6±4.5s,n=5;Vehicle组:2±2.8s,n=5)。GABA与BK的混合给药也不会降低BK诱导的疼痛(GABA+BK 组:145±14.5s,n=5;BK 组:168±9.3s,n=5)。这些数据证明GABA在外周躯体感觉系统中主要的作用位点是神经节内。结论:本实验研究发现GABA通过激活DRG神经元上的GABAA受体导致细胞膜去极化,但使大多数神经元的兴奋性降低。研究同时发现调节构成DRG局部GABA环路系统主要分子的功能可以影响外周刺激导致的大鼠疼痛行为,表明DRG局部GABA环路系统在调控外周疼痛的传导中发挥重要作用。
[Abstract]:GABA plays an important role in the transmission of pain sense signals . Methods : 1 surgical procedure : The spinal cord was not diffused into the spinal cord . Methods : 1 surgical procedure : At the depth of the spinal cord , a incision was made between the L4 - L6 spinal column and the L5 was confirmed . There was no change in the spinal cord . ( 3 ) Inflammatory pain behavior showed that the agonist , KATP channel opener and HCN channel blocker could decrease the inflammatory pain induced by bradykinin . Bradycardia ( BK , 200 渭M , 50 渭l ) injected into the hind paw resulted in intense pain and the reaction time was ( 122 卤 9.7 s , n = 21 ) . However , Saline ( 5.mu . l ) or DMSO ( 5.mu . l ) did not have an effective effect on BK - induced pain ( 119 & # xb1 ; 16.9 s , n = 8 ; 120 & # xb1 ; 15.7 s , n = 5 ) through DRG cannula injection . It was found that RTGs ( 200 渭M , 5 渭l ) could significantly reduce BK induced pain ( 63 卤 10.9 , n = 8 , P0.01 ) . Pinacidil ( PIN ) was agonist of KATP , and the injection PIN ( 200 渭M , 5 渭l ) decreased the reaction time of pain ( 66 卤 23.0s , n = 5 , P0.01 ) . At the same time , we also applied zd7288 ( ZD , 200渭M , 5渭l ) , and the time of pain response decreased to ( 76 卤 8.7 s , n = 11 , P0.01 ) . The results showed that DRG could be used as a treatment target of peripheral chronic pain . The results showed that DRG could be used as a target for peripheral chronic pain . In a small proportion of neurons , GABA did not act ( 5 / 38 ) or slightly increased AP ( 5 / 38 , 12.8 卤 4.5 AP increased to 15.6 卤 6.2 AP ) . All other small DRG neurons GABA - induced significant membrane potential depolarization ( AP - stopped neurons : from - 57.6 卤 1.8 mV to - 45.7 卤 2.0mV , n = 17 , P0.001 ; AP - increased neurons : from - 57.2 卤 4.8 mV to - 39.1 卤 1.9 mV , n = 5 , P0.05 ) . At the same time , GABA also decreased the amplitude of the first AP ( decreased AP neurons : from 46.8 卤 3.3 mV to 33.9 卤 7.7 mV , n = 17 , P0.01 ) . The decreased neurons in AP increased Reobase ( from 128.9 卤 26.9pA to 197.5 卤 44.2pA , n = 17 , P0.05 ) . Muscimol ( GABAA receptor agonist , 200渭M , 5渭l ) cannula injection had the same effect ( 21 卤 4.7 s , n = 7 , P0.01 ; BK + Vehicle group : 80 卤 5.3s , n = 7 ) . Importantly , when BK was injected into the contralateral paw , both GABA and Muscimol did not decrease BK - induced pain . ( GABA group : 71 卤 7.7 s , n = 4 ; molar Muscimol group : 69 卤 14.0s , n = 4 ) , suggesting that the drug injected by the DRG did not diffuse into the spinal cord . However , the saline paw injection did not cause pain ( 7 卤 2.8 s , n = 4 ) . The most interesting findings were the effects of Bicuculline ( GABAA antagonist , 200渭M , 5渭l ) not only aggravate BK - induced pain ( 214 卤 18.8 s , n = 6 , P0.001 ; BK + Vehicle group : 98 卤 13.9 s , n = 6 ) , and Bicucculine cannula injection could lead to significant lifting and licking of the ipsilateral paw ( 79 卤 9.0s , n = 6 , P0.01 ; Vehicle group : 21 卤 13.0s , n = 6 ) . We also tested the effects of GAT1 inhibitor NO711 ( 200 渭M , 5 渭l ) on DRG significantly reduced BK - induced pain ( 41 卤 4.8 s , n = 6 , P0.05 ; BK + Vehicle group : 74 卤 11.2s , n = 5 ) . This indicates that GAT1 blockade can lead to an increase in GABA release in DRG . Interestingly , no pain ( GABA group : 35 卤 6.5 s , n = 5 ; Vehicle group : 14 卤 3.s , n = 5 ; Vehicle group : 164 卤 23.2s , n = 5 ) ( Bicuculline group : 6 卤 4.5s , n = 5 ; Vehicle group : 2 卤 2.8 s , n = 5 ) , regardless of GABA ( 200 渭M , 50 渭l ) or Bicuculline ( 200 渭M , 50 渭l ) . Mixed administration of GABA and BK did not reduce BK - induced pain ( GABA + BK group : 145 卤 14.5 s , n = 5 ; BK group : 168 卤 9.3 s , n = 5 ) . These data demonstrate that GABA plays a major role in peripheral somatic sensory systems . Conclusion : GABA can induce depolarization of the cell membrane by activating the GABAA receptor on the DRG neurons , but the excitation of most neurons is reduced . It is also found that the regulation of the major molecules of the GABA loop system in the DRG can affect the behavior of the rat pain caused by peripheral stimulation , suggesting that the DRG local GABA loop system plays an important role in regulating the conduction of peripheral pain .

【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

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