利用CRISP-Cas9技术进行内源性c-FLIP蛋白靶向药物筛选细胞系的构建

发布时间：2018-05-08 05:32

本文选题：细胞凋亡 + cFLIP　；参考：《昆明理工大学》2017年硕士论文

【摘要】：只有细胞的扩增、分裂和死亡能够相互协调,才能维持正常组织的生长平衡。如果凋亡受到抑制,这种平衡就会被打破,细胞病死率也会降低;如果机体不能重新恢复调节,就会表现出无限增殖,最终形成肿瘤。然而恶性肿瘤又是全球死亡率最高的疾病,所以寻找癌症的有效治疗方法和特效药是目前急需解决的难题。当前,人们特别注重与肿瘤死亡相关的一个配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL),它是参与肿瘤坏死的一个控制因子,因为它具有强大特异性的诱导肿瘤细胞凋亡的能力而正常细胞对TRAIL诱导的凋亡耐受;因此,TRAIL是一个很理想的候选靶点对于癌症的治疗。然而,TRAIL是生物蛋白大分子,在生产及运输中需要消耗大量的成本,因此如果能寻找到TRAIL的类似物是非常有必要的。云南是天然药物资源的储库,如果我们从这个储库中寻找到TRAIL的类似活性物,将会大大降低成本,造福于癌症患者。但是如何从这样丰富的资源库中寻找到合适的替代物,一直是我们需要克服的难点。REFI荧光成像是由Canon创造的并且为我们的困难提供了新的思路,我们可以在募集蛋白上融合一个荧光蛋白GFP,然后构建一个能够让融合蛋白稳定表达的单克隆细胞系,最后用此细胞系筛选具有TRAIL类似功能的天然产物。通过细胞凋亡通路的相关特点,我们实验室成功构建了 PCMV6—cFLIPsK192,195L,△203-221-GFP载体,并将其转染到U20S细胞中得到了稳定表达PCMV6—cFLIPsK192,195L,△203-221_GFP的单克隆细胞系;但是用TRAIL处理该细胞系时,发现与阴性对照组的结果一样。通过查阅文献发现,A56位能够使cFLIPs与IKKγ蛋白聚集。因此将A56位突变掉,继续将此载体转染到HEK293细胞中,得到一种入核和一种不入核的细胞系,结果TRAIL治疗后并没有我想看的荧光。我们分析c-FLIPs之所以能与FADD连接,是因为它有DED,然而细胞中含有大量类似c-FLIPs DED家族蛋白如Procaspase-8、cFLIPL、cFLIPs等,所以外源转入的c-FLIPs-GFP不能被募集。因此我们选择第三代基因编辑技术CRISPR-Cas9,在cFLIPs的第五个外显子及cFLIP的第八个外显子中敲入GFP,使内源性的c-FLIP融合表达GFP。实验内容与结果:1.针对c-FLIPs的第五个外显子,成功构建了 Guide-RNA、DonorDNA。通过电转技术将它们共转到HEK293细胞中,发现有10%的细胞带有绿色荧光,但是在培养过程中发现带有绿色荧光的细胞并不发生增殖。有关文献报道:c-FLIPs的K192和195L位会被泛素化,及它特有的c端尾巴结构会促进c-FLIPs降解。而c-FLIPL不会发生此种现象,进而选择c-FLIPL的第八个外显子作为敲入GFP的靶标。2.针对c-FLIPL的第八个外显子,成功构建了 Guide-RNA、c-FLIPL(8)-GFP片段。通过脂质体转染将它们共同转染到HEK293细胞中,筛选出了带有绿色荧光的单克隆细胞系,结果用TRAIL处理该后并没有看到我们所期望的结果。3.细胞中含有大量类似c-FLIPsDED家族蛋白如Procaspase-8,因此以目前构建好的单克隆细胞为基础将内源性的Procaspase-8敲除掉,再加TRAIL观察是否有绿色荧光发生凝聚。目前所构建的单克隆细胞系还不能用于后续的筛药工程,还需要我们进一步优化。
[Abstract]:Human TRAIL is an ideal candidate target for the treatment of cancer . However , it is an ideal candidate target for cancer treatment . We successfully constructed Guide - RNA , c - FLIPL ( 8 ) - GFP fragment . The monoclonal cell line with green fluorescence was screened by transfection with liposome . The results showed that there was a large amount of similar c - FLIPsDED family protein in the cells , such as Procter - 8 .

【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R91

【参考文献】