组织蛋白酶D功能抑制在α-synuclein降解障碍中的作用及机制研究

发布时间：2018-05-11 23:12

  本文选题：组织蛋白酶D + α-synuclein　； 参考：《苏州大学》2016年博士论文

【摘要】：目的:探讨组织蛋白酶D(cathepsin D)在帕金森病动物模型中脑黑质区多巴胺能神经元中功能抑制导致α-synuclein聚积的机制;初步探索多巴胺能神经细胞中cathepsin D的调控机制。方法:在鱼藤酮皮下注射Lewis大鼠(8周)制备的帕金森大鼠模型和鱼藤酮(500nM)干预人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞模型基础上,免疫荧光和免疫印迹法检测鱼藤酮引起的多巴胺能神经元受损,溶酶体标记蛋白LAMP-1的表达情况,α-synuclein和cathepsin D蛋白表达状态改变,RT-PCR和real-time PCR法检测mRNA水平,并检测鱼藤酮对SH-SY5Y细胞中cathepsin D酶活性的影响。将慢病毒构建的cathepsin D RNA干扰(LV-ctsd-RNAi-GFP)通过立体定位法注射到大鼠脑内黑质致密部,免疫荧光法检测病毒感染位置和效率,Western blot检测LV-ctsd-RNAi对多巴胺能神经元存活及cathepsin D蛋白和α-synuclein蛋白表达状态的影响。在SH-SY5Y细胞中给予慢病毒构建的cathepsin D干扰处理后,荧光显微镜观察病毒感染率;CCK-8检测LV-ctsd-RNAi对细胞增殖能力的影响;Western blot检测LV-ctsd-RNAi对细胞中cathepsin D蛋白和α-synuclein蛋白表达的影响。在SH-SY5Y细胞和cathepsin D基因被敲低的SH-SY5Y细胞中,采用自噬诱导剂海藻糖(Trehalose)诱导自噬后,给予鱼藤酮干预,使被鱼藤酮阻滞的自噬流得到部分恢复,比较两种细胞中自噬底物蛋白的水平,研究cathepsin D在自噬溶酶体通路中的作用。组织蛋白酶L(Cathepsin L)特异性抑制剂Z-FY-CHO预处理SH-SY5Y细胞后,鱼藤酮干预细胞,Western blot检测细胞内cathepsin L,cathepsin D,以及自噬底物蛋白LC3II、P62和α-synuclein的蛋白水平,初步研究cathepsin L对cathepsin D的调控作用。结果:鱼藤酮长期皮下给药能导致Lewis大鼠中脑黑质区TH阳性细胞丢失,发生病变的多巴胺能神经元内有大量α-synuclein聚积,成熟cathepsin D蛋白水平降低,同时溶酶体标记物LAMP-1表达显著降低,且cathepsin D表达减少的神经元内α-synuclein聚积明显。体外模型中,鱼藤酮明显上调α-synuclein蛋白水平,降低成熟cathepin D的蛋白水平和cathepsin D酶活性,但α-synuclein和cathepin D的mRNA水平都未见明显变化。慢病毒介导的cathepsin D基因干扰,成功敲低Lewis大鼠多巴胺能神经元和SH-SY5Y细胞内的cathepsin D表达水平,且影响神经元的生存和细胞的增殖,进一步导致α-synuclein蛋白蓄积。Cathepsin D基因干扰加重了鱼藤酮诱导的自噬底物蛋白堆积。Cathepsin L抑制剂能减轻鱼藤酮对cathepsin D的抑制作用,缓和鱼藤酮诱导的自噬底物蛋白堆积。结论:在鱼藤酮的毒性作用下,多巴胺能神经细胞内,cathepsin D的成熟受抑制和酶活性降低,导致自噬溶酶体通路阻滞,可能是造成α-synuclein降解障碍,从而发生聚积,引发帕金森症的主要原因之一;保持cathepsin D的活性和蛋白降解功能可能成为治疗帕金森病药物研发的新靶点。
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本文编号：1876050