阿司匹林靶向乙酰肝素酶抗肿瘤转移机制研究

发布时间：2018-05-16 01:43

本文选题：肿瘤转移 + 血管新生　；参考：《浙江大学》2015年博士论文

【摘要】：研究目的：肿瘤转移是抗肿瘤治疗的热点问题,但因其病理过程的复杂性,目前仍缺乏有效的针对性药物。非甾体类抗炎药阿司匹林,在临床上应用已经超过百余年,近年来大量流行病学调查显示,阿司匹林具有明显的抗肿瘤转移作用。通过前期针对阿司匹林的药物-蛋白质组学研究发现,硫酸乙酰肝素酶为其潜在作用靶点。本研究全面评价乙酰肝素酶作为阿司匹林靶点的生物学特性,并考察阿司匹林通过乙酰肝素酶发挥抗肿瘤转移的作用。方法与结果：第一部分阿司匹林抑制乙酰肝素酶酶活机制探讨构建HTRF法筛选乙酰肝素酶抑制剂的分子平台,并以HTRF法筛选化合物库,结果显示阿司匹林具有明显的抑制乙酰肝素酶作用。Pull-down结合冷探针竞争实验结果显示,阿司匹林能够与乙酰肝素酶结合；SPR检测表明,二者结合于非肝素类结合位点。利用分子模拟技术,模拟阿司匹林、水杨酸及Biotin-阿司匹林与乙酰肝素酶的结合模式,阿司匹林可能结合于乙酰肝素酶的G]u225位酶活性区域。第二部分阿司匹林对乙酰肝素酶引起的相关细胞生物学效应评价1.阿司匹林抑制乙酰肝素酶介导的肿瘤细胞迁移与侵袭行为HTRF酶活检测实验明确了阿司匹林对肿瘤细胞中乙酰肝素酶的酶活功能具有抑制作用。细胞水平检测表明阿司匹林可以抑制乙酰肝素酶引起的相关效应,可剂量依赖性地抑制多种肿瘤细胞的迁移与侵袭。同时,高表达乙酰肝素酶、干扰乙酰肝素酶或者外源加入乙酰肝素酶均能够逆转阿司匹林的抑制肿瘤细胞迁移与侵袭的作用。2.阿司匹林抑制乙酰肝素酶介导的细胞黏附免疫荧光实验表明阿司匹林能够抑制外源加入乙酰肝素酶诱导的syndecan-1内化过程。提示了阿司匹林能够影响乙酰肝素酶介导的细胞黏附。乙酰肝素酶高表达引起Rac-1和Rho A的活化进而诱导F-actin重排及伪足的形成,最终促进肿瘤细胞的黏附。免疫荧光和蛋白检测均表明阿司匹林能够抑制这一现象从而发挥抑制肿瘤细胞黏附的作用。3.阿司匹林抑制乙酰肝素酶介导的血管新生通过ELISA法检测VEGF的释放显示,阿司匹林能够剂量依赖性地抑制肿瘤细胞对于VEGF的释放。同样高表达或者干扰乙酰肝素酶均能逆转阿司匹林的抑制作用。采用多种新生血管生成评价模型,我们对阿司匹林的康血管新生作用进行了研究。结果显示：阿司匹林能够在体外无细胞毒浓度下即显著抑制HUVEC的管腔形成,浓度为4mM时,抑制效果最显著,网状结构几乎完全消失,抑制率达60.8%。同时,阿司匹林能够显著抑制大鼠动脉环的血管萌芽以及鸡胚尿囊膜血管新生。4.阿司匹林抑制乙酰肝素酶介导的信号通路活化乙酰肝素酶高表达能够引起相关通路活化如STA3、STAT5、Src、Erk等活化,上调其磷酸化水平。阿司匹林处理细胞后,western blot结果显示,阿司匹林能够时间及剂量依赖性地抑制上述信号通路的活化,下调其磷酸化水平。第三部分阿司匹林对乙酰肝素酶介导的体内生物学效应评价基于阿司匹林的体外抑制乙酰肝素酶相关效应,我们运用动物模型进一步评价阿司匹林抑制转移和血管新生的作用。结果表明,阿司匹林以62.5、125、250mg/kg口服给药,能够显著抑制B16F10的肺转移,抑制率分别为19.9%,49.6%和65.5%。在MDA-MB-435模型中,125、250mg/kg口服给药也显示出抑制肿瘤生长的作用,T/C分别为61.69%和47.79%。以内皮细胞表面标记物CD31为指标,免疫组化结果显示,阿司匹林治疗后肿瘤组织中新生血管数目明显减少,下降了44.48%和66.9%。对肿瘤组织进行western blot检测,结果显示阿司匹林能够抑制STAT3等的活化,这一结果与细胞水平结果一致。另外我们在阿司匹林治疗组的肿瘤组织中观察到乙酰肝素酶表达的下调,为此我们对肿瘤细胞采取长时间加药刺激处理,同样观察到阿司匹林长时间作用之后,随着剂量的增加同样能够下调乙酰肝素酶的蛋白表达水平。但是,RQ-PCR检测发现阿司匹林作用后乙酰肝素酶的mRNA水平上调。这一结果表明阿司匹林可能是通过促进降解来下调乙酰肝素酶的蛋白表达,利用蛋白酶抑制剂的回转实验也验证了这一结果。结论：本文证明了阿司匹林可能通过与乙酰肝素酶的Glu225酶活相关区域结合来抑制其酶活性,进而发挥抑制肿瘤转移与血管新生的作用。同时阿司匹林兼具乙酰肝素酶非酶活功能抑制作用。本研究证实了乙酰肝素酶为阿司匹林的作用靶点,并全面评价了阿司匹林针对乙酰肝素酶的抗转移作用特性,为全面认识阿司匹林抗肿瘤作用机制提供了新的理论基础,同时也为乙酰肝素酶小分子抑制剂的研发提供了新的方向。
[Abstract]:The aim of this study was to investigate the effect of heparan sulfate on anti - tumor metastasis of aspirin .
Aspirin inhibits heparanase - mediated cell adhesion . It is suggested that aspirin can inhibit the migration and invasion of heparanase .

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96

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