HPV11.HaCaT重组细胞作为体外药效学模型的完整性和应用性研究

发布时间：2018-05-20 11:01

本文选题：尖锐湿疣 + 人乳头瘤病毒　；参考：《北京协和医学院》2016年博士论文

【摘要】：尖锐湿疣是由人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)引起的一种性传播疾病,其主要的病原体为HPV 6型和11型。尖锐湿疣的发病率逐年升高,日益成为严峻的公共卫生问题。由于HPV的种属特异性以及生命周期对细胞分化的依赖性,HPV的体内、体外感染模型发展缓慢,使HPV生物学行为的研究以及抗HPV药物研发受到限制。本课题基于课题组的以往研究,利用已有方法建立含HPV 11游离基因的HaCaT重组细胞(HPV11.HaCaT细胞),从细胞生长特性、病毒功能基因的表达,以及病毒基因对细胞内微环境的影响等方面考核HPV11.HaCaT重组细胞作为抗HPV 11体外药效学模型的完整性；并通过几种化合物在该系统中的实践性应用,探索该系统作为体外筛选抗HPV 11药物时药效指标确立的可行性,为后续向药效学模型转化的深入研究提供数据;同时Affymetrix基因表达谱芯片的结果为后续研究提示新的思路。第一部分HPV11.HaCaT重组细胞作为体外药效模型的完整性研究目的：构建含HPV11游离基因的HaCaT重组细胞,并验证其结构和功能的完整性。方法：利用全基因转染的方法构建HPV11.HaCaT细胞,通过测定生长曲线及流式细胞术分别检测细胞在基底样培养和分化状态培养时的生长特性;利用聚合酶链式反应(PCR)及细胞免疫荧光验证基底样及分化状态下HPV11.HaCaT细胞中HPV11早期基因mRNA及蛋白的表达；利用Western Blot法研究HPV11.HaCaT细胞I型IFN通路的活化：利用基因沉默技术干扰重组细胞内HPV11E7基因,检测E7基因对重组细胞内I型IFN信号通路激活的影响。结果：(1)利用前期所建方法成功构建的HPV11.HaCaT重组细胞。与正常HaCaT细胞相比,重组细胞在一定程度上生长速度加快,S期细胞数显著增多。重组细胞中可成功检测到HPV11早期基因E1∧E4、E5、E6、 E7mRNA及E7蛋白的表达。(2)利用甲基纤维素半固体培养可成功使HPV11.HaCaT细胞趋于分化,终末分化指示内披蛋白高表达,分化状态HPV11.HaCaT细胞较基底样细胞的生长增殖加快,且细胞内HPV11 E5、E6、E7mRNA及E7蛋白的表达均上调。(3)外源性rhIFN-α刺激后,HPV11.HaCaT细胞内IFN信号通路可被激活,但胞内JAK/STAT通路的激活水平低于正常HaCaT细胞。(4)用Poly (I:C)刺激HPV11.HaCaT细胞后,细胞内NF-κB相关蛋白可活化,但活化水平与正常HaCaT细胞差异不大。(5)通过siRNA可以成功干扰HPV11.HaCaT细胞中HPV11 E7表达,干扰后的细胞内IFN信号通路激活情况发生变化。结论：通过全基因转染后成功构建的HPV1 1.HaCaT细胞在生长特性、病毒功能基因的完整表达,以及病毒基因组对细胞内IFN信号通路的影响等方面均提示该细胞模型作为体外感染模拟系统具有一定的完整性。第二部分HPV11.HaCaT重组细胞作为体外药效模型的应用性研究目的：通过几种化合物在HPV11.HaCaT细胞中的实践性应用,探索该系统作为体外筛选抗HPV11药物时药效指标确立的可行性。方法：利用MTT法探索rhIFN-α和 rhIFN-ω,化合物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、姜黄素,以及ALA-PDT的治疗方法对HPV11.HaCaT细胞细胞生长增殖的影响；以HPV11 E6、E7作为指标,通过实时荧光定量PCR测定上述受试物或治疗方法对HPV11.HaCaT重组细胞中HPV11 E6、E7mRNA表达的影响。结果：(1)rhIFN-α及 rhIFN-ω对 HPV11.HaCaT细胞的增殖无明显抑制作用;EGCG及姜黄素对HPV11.HaCaT细胞的生长有一定的抑制作用,并呈剂量和时间依赖趋势；0.75mmol/L以上浓度的5-ALA联合20J/cm2以上剂量红光照射可抑制HPV11.HaCaT细胞增殖。(2) 102 IU/ml rhIFN-α及 rhIFN-ω可上调HPV11.HaCaT细胞中E6、E7 mRNA表达,但103IU/ml及以上浓度的rhIFN-α及 rhIFN-ω均可明显抑制HPV11 E6、E7 mRNA表达；EGCG及姜黄素均明显抑制HPV11.HaCaT细胞中HPV11E6、E7 mRNA表达;0.375mmol/L 5-ALA联合20 J/cm2红光照射即可以显著抑制HPV11 E6、E7 mRNA的表达。(3)受试物作用于分化状态的HPV11.HaCaT细胞后,104 IU/ml rhIFN-α可对HPV11 E6、E7mRNA表达产生显著抑制作用,但EGCG及姜黄素的抑制作用较弱或无明显抑制作用。结论：在HPV11.HaCaT重组细胞系统中,细胞增殖反映了受试物对感染细胞生长的影响,可作为药效指标之一,但此作用是非特异性的。通过测定HPV11 E6、 E7 mRNA表达,可以测试受试物针对细胞中病毒早期基因的影响,因此可作为较特异的药效指标。以上结果提示HPV11.HaCaT重组细胞转化为抗HPV11体外药效学模型的可行性。第三部分通过Affymetrix基因表达谱芯片探索HPV11.HaCaT重组细胞后续研究的方向目的：利用基因表达谱芯片探索负载HPV11基因组后,载体HaCaT细胞内mRNA水平发生的改变,为后续深入研究打下基础。方法：利用Affymetrix基因表达谱芯片,对比HPV11.HaCaT细胞及HaCaT细胞中基因组mRNA的差异。结果：与HaCaT细胞相比,HPV11.HaCaT细胞中有808种基因上调,900中基因下调。Pathway富集分析后,根据P值排序,第一位为系统性红斑狼疮相关基因,第二位为肿瘤相关基因。结论：后续研究中可以将HPV11.HaCaT细胞作为探索研究HPV11基因与宿主细胞间相互关系的HPV11感染细胞模型。
[Abstract]:HPV 11 . HaCaT cells ( HPV11 . HaCaT cells ) have been established by the methods of human papillomavirus ( HPV ) .
In this paper , the feasibility of the application of several compounds in the system was explored . The feasibility of the system as an in vitro screening of anti - HPV 11 drug was explored . The results of the analysis of the expression profiles of human papillomavirus 11 . HaCaT cells were used to construct HPV11 . HaCaT cells were used to construct HPV11 . HaCaT cells were used to test the growth characteristics of HPV11 . HaCaT cells in the culture and differentiation of HPV11 . The expression of HPV11 mRNA and protein in HPV11 . HaCaT cells was verified by polymerase chain reaction ( PCR ) and immunofluorescence assay .
The expression of HPV11 , E6 , E6 , E7 mRNA and E7 protein in HPV11 and HaCaT cells was detected by Western Blot .
Results : ( 1 ) rhIFN - 伪 and rhIFN - 蠅 did not inhibit the proliferation of HPV11 . HaCaT cells . The results showed that ( 1 ) rhIFN - 伪 and rhIFN - 蠅 inhibited HPV11 . HaCaT cell proliferation .
( 2 ) 102 IU / ml rhIFN - 伪 and rhIFN - 蠅 could up - regulate the expression of E6 , E7 mRNA in HPV11 . HaCaT cells , but rhIFN - 伪 and rhIFN - 蠅 at 103IU / ml and above could significantly inhibit the expression of HPV11 E6 and E7 mRNA .
The expression of HPV11 E6 , E7 mRNA in HPV11 and HaCaT cells was significantly inhibited by the expression of HPV11 E6 and E7 mRNA .
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96

【相似文献】