具有调节NF-κB信号通路作用的微生物代谢产物筛选及分离纯化鉴定

发布时间：2018-05-30 19:30

  本文选题：NF-κB + 荧光素酶报告基因　； 参考：《广西医科大学》2014年硕士论文

【摘要】：目的: NF-κB是普遍存在于细胞浆中的一种转录调节因子,很多疾病与NF-κB信号通路的激活和抑制有关。本课题建立了适合大量微生物代谢产物提取物的筛选和提取方法，采用双荧光素酶报告基因分析方法研究525种代谢产物对NF-κB信号通路的激活和抑制情况，对筛选得到的活性菌株进行发酵罐发酵，对分离得到的化合物进行结构鉴定和生物活性评价，然后进一步做相关基础研究。 方法：微生物接种液体培养基中，于180r/min、30℃摇床培养，3d后，加入终浓度70%的乙醇裂解过夜。裂解物离心，取上清，旋转蒸发浓缩并冷冻干燥，获得微生物代谢产物提取物，采用双荧光素酶报告基因分析方法进行筛选，将pNF-ΚB-luc、pRL-TK质粒共转染HEK293细胞，转染后6h加入微生物代谢产物或TNFα（阳性对照），继续培养24h后，检测荧光素酶活性。 对3092#活性菌株进行大规模发酵，培养条件为可溶性淀粉1%、葡萄糖2%、牛肉膏0.1%、NaCl0.2%、K2HPO40.025%、酵母提取物1%、CaCO30.2%，PH=7。我们以此条件进行了三批发酵罐发酵，，发酵液经过初步提取后得到35.7g粗提物。粗提物采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、TLC、HPLC等分离方法进行分离，化合物采用HR-MS、13C-NMR、1H-NMR等方法鉴别。 对分离到的单体化合物进行双荧光素酶报告基因分析，研究这些化合物对NF-κB信号通路的激活和抑制情况 结果：在第一轮筛选中，发现30种代谢物能够激活NF-κB信号通路；28种代谢物能够抑制NF-κB信号通路。在第二轮筛选中，有13种代谢物能够明显激活NF-κB信号通路，没有明显抑制NF-κB信号通路的代谢物。在第三轮筛选和最后验证中，发现６种代谢物均能激活NF-κB信号通路。 从粗提物中得到一系列脂肽地衣素类物质（L31-L37）,通过与文献比对，确定结构如下： L32：cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (isoC13)和cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (anteisoC13) L34：cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (isoC14)。 L36：cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (isoC15)和cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (anteisoC15) L33：cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (isoC13或anteisoC13)和cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Val7]-β-OH fatty acid(isoC14或anteisoC14) L35：cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Ile7]-β-OH fatty acid (nC14)和cyclo-[L-Gln1→L-Leu2→D-Leu3→L-Val4→L-Asp5→D-Leu6→L-Val7]-β-OH fatty acid (nC15) 此外，还分离到5个其他类单体化合物，分离鉴定了其中三个，名称分别为亮氨酸、正十六烷酸、3-羟基癸烷酸。
[Abstract]:Objective: NF- 魏 B is a transcriptional regulator in cytoplasm. Many diseases are related to the activation and inhibition of NF- 魏 B signaling pathway. In this study, a suitable method for screening and extracting a large number of microbial metabolite extracts was established. The activation and inhibition of 525 metabolites on NF- 魏 B signaling pathway were studied by double luciferase reporter gene analysis. The active strains were fermented in fermenter, the compounds were identified by structure identification and bioactivity evaluation, and further basic research was done. Methods: microbes were inoculated in liquid medium and incubated in a shaking bed at 180 r / min ~ 30 鈩

本文编号：1956506