活性卤酚对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及其与HO-1蛋白的相关性
本文选题：活性卤酚 + 心肌细胞 ； 参考：《山西医科大学》2017年硕士论文
【摘要】：研究背景:课题组前期针对天然来源的卤酚进行了连续的系统的结构优化,已经设计合成了二苯甲酮、二苯甲烷、苯基呋喃-2-基甲酮、苯基噻吩-2-基甲酮四种骨架类型的卤酚化合物,通过活性的系统筛选,获得了多个体外具有高活性的新型卤酚化合物。其中,对氧化损伤的血管内皮细胞具有高保护活性的是2,4’,5’-三羟基-5,2’-二溴二苯甲酮(LM49)、4,5-二羟基2,3-二溴二苯甲酮(LM48)和3,4-二羟基-3’-氯二苯甲酮(LM46),其EC50分别为0.4μmol/L,0.8μmol/L和5.0μmol/L。通过进一步的在体研究,表明这3个化合物都具有显著的对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用,且药理活性最好的的是LM49,其次是LM48和LM46。此外,初步的作用机制研究已经证实HO-1是卤酚保护血管内皮细胞的关键蛋白。目的:明确活性卤酚LM46、LM48和LM49对Na_2S_2O_4致H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用,并探讨HO-1蛋白与该保护作用的相关性。方法:1.Na_2S_2O_4氧耗法建立H9c2细胞缺氧复氧模型。2.采用MTT法检测细胞相对活力,流式细胞仪检测ROS和凋亡,试剂盒检测LDH,MDA,SOD,CK,明确活性卤酚对缺氧复氧心肌细胞的保护作用。3.采用Western blot和PCR法检测活性卤酚对HO-1的蛋白和基因表达的影响。4.采用特异性阻断剂Zn PP阻断HO-1,MTT法检测细胞活力,活性荧光定量试剂盒检测HO-1活性,明确卤酚化合物对心肌细胞保护作用与关键蛋白HO-1的相关性。5.探讨活性卤酚对HO-1的诱导是否依赖于新HO-1mRNA的转录,在加入活性卤酚之前加入mRNA合成抑制剂actinomycin D(Act D),western检测HO-1蛋白的表达。探讨活性卤酚对HO-1的诱导是否依赖于新蛋白的合成,在加入卤酚化合物之前加入蛋白合成抑制剂cycloheximide(CHX),PCR检测HO-1mRNA的表达。6.荧光光谱法研究卤酚化合物和HO-1蛋白的相互作用,探讨它们的相互作用是否和前面的细胞保护活性及对HO-1基因水平的诱导顺序一致。结果:1.LM46、LM48和LM49在设定剂量2.5,5和10μmol/L范围内可剂量依赖性地提高细胞相对活力,降低细胞凋亡率和ROS水平,升高SOD活力,抑制LDH、CK、MDA释放,且对心肌细胞的保护活性顺序为LM49LM48LM46。2.三个卤酚化合物均可显著诱导HO-1蛋白表达及升高mRNA水平,并呈量效关系和时效关系,而且对HO-1蛋白和基因表达的诱导作用顺序为LM49LM48LM46。3.三个卤酚化合物均可剂量依赖性的提高心肌细胞HO-1的活性,其诱导顺序为LM49LM48LM46;采用Zn PP阻断后,给药组的HO-1活性及细胞保护率均显著降低。4.加入转录抑制剂Act D后,三个卤酚化合物对HO-1蛋白表达的诱导均较单独给药显著降低;加入蛋白合成抑制剂CHX后,三个卤酚化合物给药组的HO-1 mRNA水平均较单独给药组升高。5.三个卤酚化合物均能使HO-1的荧光光谱猝灭,猝灭机制为静态猝灭,结合常数相差不大。从热力学参数判断,LM46与HO-1间相互作用力主要为范德华力、氢键或质子化等作用力;LM48和LM49与HO-1间相互作用力主要为静电作用和疏水作用力。随着卤酚LM48,LM49浓度的增加,同步荧光光谱色氨酸的最大发射波长略有红移,显示HO-1色氨酸残基附近的微环境疏水性降低,极性增强。结合三维光谱等高线图,可以推断在卤酚化合物存在下HO-1的构象发生了变化。结论:1.活性卤酚对缺氧复氧损伤的心肌细胞有明确的保护作用,该保护作用与抗氧化应激、抑制细胞凋亡相关,活性顺序为LM49LM48LM46。2.HO-1是活性卤酚保护心肌细胞的关键蛋白,活性卤酚可通过诱导HO-1的基因转录和翻译,升高HO-1蛋白表达,提高HO-1活性,从而发挥对心肌细胞的保护作用。3.卤酚对HO-1蛋白的诱导表达依赖于HO-1基因转录水平的升高,卤酚对HO-1基因转录的调控并不依赖于新蛋白的合成。4.通过荧光光谱法证实了卤酚化合物与HO-1蛋白之间存在相互作用。
[Abstract]:The protective effects of active halophenols LM46 , LM48 and LM49 on myocardial ischemia - reperfusion injury in rats were studied . 3 . The induction of HO - 1 protein was dependent on the level of HO - 1 gene transcription , and the regulation of halophenol on HO - 1 gene transcription did not depend on the synthesis of new protein . 4 . The interaction between the halophenol compound and HO - 1 protein was confirmed by fluorescence spectrometry .
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R914;R96
【参考文献】
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，本文编号：1963062
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