新SansalvamideA环肽衍生物抗肿瘤活性的研究

发布时间：2018-06-09 14:23

  本文选题：SansalvamideA + B16　； 参考：《河北医科大学》2014年博士论文

【摘要】：肿瘤的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，严重危胁人类健康。目前，药物抗肿瘤治疗疗效仍不理想，主要原因在于传统的抗肿瘤药物在杀伤患者体内肿瘤细胞的同时，其巨大的毒副作用不可避免。因此，寻找新型高效且低毒的抗肿瘤药物是生物医药领域的重大课题。天然产物化学研究一直是制药业新药研制的重要途径和主要来源，天然产物成分具有结构新颖、疗效高、毒副作用小等优点，所以目前天然产物化学及其研究成果已广泛应用于医药业。 Sansalvamide A是1999年被报道的从海洋真菌中分离出的一种天然环五肽酯，具有很高的亲脂性及显著的抗肿瘤能力。Sansalvamide A环肽是由Sansalvamide A改造所得到的一类化合物。经过多年的研究，新报道的Sansalvamide A环肽具有200余种，其中很多衍生物的活性明显提高。在本课题中，由河北科技大学药用分子化学重点实验室提供了9种新合成Sansalvamide A环肽衍生物，选取小鼠恶性黑色素瘤B16细胞，人乳腺癌MCF-7细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞三种细胞模型做体外抗肿瘤活性研究，观察这9种新化合物的抗肿瘤活性。同时，应用细胞培养技术原代培养人外周血淋巴细胞和SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞，用于研究9种新化合物对这两种正常细胞模型生长的抑制作用。通过抗肿瘤活性筛选，选择活性较好的化合物5（H-10）和化合物9（H-15）为研究重点，用小鼠恶性黑色素瘤B16细胞为模型，对化合物H-10和化合物H-15抑制肿瘤细胞增殖的机制做进一步研究。 具体研究内容和结果如下：第一部分Sansalvamide A环肽衍生物抗肿瘤活性及对正常细胞毒性的研 究 目的：9种新型SansalvamideA环肽衍生物抗肿瘤活性筛选及其对正常细胞毒性的研究。 方法：应用细胞培养技术培养小鼠恶性黑色素瘤B16细胞，人乳腺癌MCF-7细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞，做为肿瘤细胞模型用于9种新型SansalvamideA环肽衍生物抗肿瘤活性筛选。原代培养人外周血淋巴细胞和SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞，用于研究9种新化合物对这两种正常细胞模型生长的抑制作用。磺酰罗丹明B（SRB）比色分析法分析结果。到置相差显微镜观察化合物作用不同时间后B16细胞，淋巴细胞和大鼠平滑肌细胞（VSMC）形态，数量及生长状态的变化情况。 结果： 19种Sansalvamide A环肽衍生物对小鼠恶性黑色素瘤B16细胞，人乳腺癌MCF-7细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖具有抑制作用，用SRB比色法测定空白组以及1%DMSO组48h后吸光度（OD）值，通过比较发现1%DMSO（溶解化合物溶剂的最大量）对B16，MCF-7和MDA-MB-231三种细胞的增殖无影响，P0.05。除化合物6，8和9在50μM对MDA-MB-231增殖无抑制作用外，9种化合物对这三种细胞都显示出了抗肿瘤活性。对于B16细胞，化合物2，5和6抑制率最强，分别为82.43%，81.79%和83.19%；对于MCF-7细胞，抑制率最强的三种化合物分别为化合物5，，64.19%，化合物9，51.08%和化合物4，50.89%；对于MDA-MB-231细胞，化合物4和5作用最强，抑制率分别为68.04%和66.56%。 29种化合物对人外周血淋巴细胞和SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞的增殖无明显抑制作用。 3化合物H-10可使B16细胞出现凋亡和分化的形态学改变；化合物H-15可使B16细胞出现明显的分化形态改变。 结论：9种SansalvamideA环肽衍生物具有抗肿瘤活性且对正常细胞毒性较小；化合物H-10对多种肿瘤细胞具有活性，考虑具有诱导B16细胞凋亡的作用；化合物H-15可能通过诱导B16细胞分化抑制其增殖。 第二部分新型环五肽H-10抑制B16细胞增殖机制的研究 目的：研究化合物H-10抑制B16细胞增殖的机制。 方法：磺酰罗丹明B比色分析法研究化合物H-10抑制B16细胞增殖的浓度依赖性，细胞计数法绘制生长曲线研究化合物H-10抑制B16增殖的时间依赖性。流式细胞学技术分析B16细胞经化合物H-10作用后凋亡细胞DNA含量。Western Blot检测凋亡相关蛋白caspase-3，caspase-8和caspase-9表达的情况。 结果： 1化合物H-10抑制B16细胞生长具有浓度依赖性：1%DMSO组与空白组相比，增殖率无明显变化，P0.05。经不同浓度化合物H-10（0.1、1、10、50和100μM）处理48h后，B16细胞增殖率逐渐降低。与对照组相比，100μM组P0.01，50μM组P0.01，10μM组P0.05，其增值率均明显降低。同时在光学显微镜下可以明显观察到B16经化合物H-10作用后呈现的凋亡形态。经公式计算得到化合物H-10作用B16细胞48h的IC50（半抑制浓度）为39.68μM。 2化合物H-10抑制B16细胞生长具有时间依赖性：经浓度为50μM的化合物H-10作用B16细胞24h、48h、72h、96h、120h和144h后计数细胞数，与对照组相比，细胞生长受到明显抑制。 3化合物H-10具有诱导B16细胞凋亡的作用：流式细胞学结果显示，经浓度为50μM的化合物H-10作用B16细胞24h后，出现明显DNA亚二倍体峰，凋亡细胞比例为(9.21±4.62)%，与对照组凋亡比例(0.96±0.22)%相比，P0.05，结果具有统计学意义。Western Blot结果显示，经10、30和50μM化合物H-10作用后，caspase-3随药物浓度升高其表达量上升。 4化合物H-10诱导B16细胞凋亡通过线粒体途径：经10、30和50μM化合物H-10作用后，通过线粒体途径诱导细胞凋亡的caspase-9随药物浓度升高其表达量上升，而与外源性凋亡相关的caspase-8没有明显变化。 结论：化合物H-10对B16细胞的增殖具有很强的抑制作用，且作用效应具有显著的浓度依赖性和时间依赖性。化合物H-10作用B16细胞48h的IC50为39.68μM。化合物H-10具有诱导B16细胞凋亡的作用，化合物H-10诱导B16细胞凋亡通过线粒体途径。 第三部分新型环五肽H-15抑制B16细胞增殖机制的研究 目的：研究化合物H-15抑制B16细胞增殖的机制。 方法：磺酰罗丹明B比色分析法研究化合物H-15抑制B16细胞增殖的浓度依赖性，细胞计数法绘制生长曲线研究化合物H-15抑制B16增殖的时间依赖性。检测B16细胞经化合物H-15作用后黑色素分泌量的变化。RT-PCR检测B16细胞经化合物H-15作用后干细胞基因Foxd3，Klf4，Sox2和Nanog的表达。Western Blot检测酪氨酸酶，Sox2和Foxd3表达的情况。 结果： 1化合物H-15抑制B16细胞生长具有浓度依赖性：1%DMSO组与空白组相比，增殖率无明显变化，P0.05。经不同浓度化合物H-15（0.1、1、10、50和100μM）处理48h后，B16细胞增殖率逐渐降低。化合物H-15作用B16细胞与对照组相比，50μM组和10μM组P0.01，其增值率均明显降低。经公式计算得到化合物H-15作用B16细胞48h的IC50为69.44μM。 2化合物H-15抑制B16细胞生长具有时间依赖性：经浓度为50μM的化合物H-15作用B16细胞24h、48h、72h、96h、120h和144h后计数细胞数，与对照组相比，细胞生长受到明显抑制。 350μM化合物H-15作用B16细胞48h后细胞黑色素含量较对照组增高：经酶标仪测定50μM化合物H-15作用B16细胞48h后吸光度值为0.1743±0.0227，对照组吸光度值为0.0788±0.0039，两组间比较P0.01，差异具有统计学意义，说明经化合物H-15作用后的B16细胞分泌黑色素含量明显增加。 450μM化合物H-15作用B16细胞48h后酪氨酸酶（TYR）的表达增加：经浓度为50μM的化合物H-15作用B16细胞48后，酪氨酸酶（TYR）的表达较空白组增高。 5化合物H-15具有抑制Sox2, Foxd3基因表达的作用：RT-PCR结果显示，经10、30和50μM化合物H-15作用24h后，Sox2和Foxd3的表达呈下降趋势，Klf4的表达没有明显变化，Nanog的表达没有规律性。Western-blot结果显示，经10、30和50μM化合物H-15作用24h后，Sox2和Foxd3的表达呈下降趋势。说明化合物H-15具有抑制B16细胞干细胞特性的作用。 结论：化合物H-15对B16细胞的增殖具抑制作用，且作用效应具有显著的浓度依赖性和时间依赖性。化合物H-15作用B16细胞48h的IC50为69.44μM。化合物H-15具有诱导B16细胞分化的作用，经化合物H-15作用过的B16细胞分泌黑色素的能力增强。化合物H-15抑制了B16细胞Sox2和Foxd3的表达，使其肿瘤干细胞的特性受到抑制。
[Abstract]:The incidence and mortality of tumor are increasing year by year, which seriously threaten human health. At present, the effect of antitumor therapy is still not ideal, the main reason is that the traditional antitumor drugs are killing the tumor cells in the body of the patients, and their huge toxic and side effects can not be avoided. Therefore, to find a new and highly effective and low toxic antitumor drug. The chemical research of natural products has always been an important way and main source for the development of new drugs in the pharmaceutical industry. The natural product composition has the advantages of novel structure, high curative effect and small side effect. So the natural product chemistry and its research results have been widely used in the medicine industry at present.
Sansalvamide A is a kind of natural ring five peptide isolated from marine fungi reported in 1999. It has high lipophilicity and significant antitumor ability,.Sansalvamide A cyclic peptide is a kind of compound obtained by Sansalvamide A transformation. After years of research, more than 200 species of Sansalvamide A cyclones have been reported, many of which have been reported. In this subject, 9 new synthetic Sansalvamide A cyclic peptide derivatives were provided by the Key Laboratory of pharmaceutical molecular chemistry of Hebei University Of Science and Technology, and the anti tumor activity of three cell models of human breast cancer B16 cells, human breast cancer MCF-7 cells and human breast cancer MDA-MB-231 cells was studied in vitro. To investigate the antitumor activity of the 9 new compounds, the primary culture of human peripheral blood lymphocytes and SD rat aortic vascular smooth muscle cells was used to study the inhibitory effects of 9 new compounds on the growth of the two normal cell models. By screening the antitumor activity, the active compounds 5 (H-10) were selected. Compound 9 (H-15) is the focus of the study. A mouse malignant melanoma B16 cell is used as a model to further study the mechanism of compound H-10 and compound H-15 to inhibit the proliferation of tumor cells.
The research contents and results are as follows: Part One: the antitumor activity and cytotoxicity of Sansalvamide A cyclic peptide derivatives
investigate
Objective: To study the screening of 9 new SansalvamideA cyclic peptide derivatives and their cytotoxicity to normal cells.
Methods: the mouse malignant melanoma B16 cells, human breast cancer MCF-7 cells and human breast cancer MDA-MB-231 cells were cultured with cell culture technique. The tumor cell model was used as the tumor cell model for screening the anti-tumor activity of 9 new SansalvamideA cyclic peptide derivatives. The primary culture of human peripheral blood lymphatic cells and the vascular smooth muscle cells of the aorta of SD rats were used. The inhibitory effects of 9 new compounds on the growth of these two normal cell models were investigated. The results of sulfonyl Luo Danming B (SRB) colorimetric analysis were used to observe the changes in the morphology, quantity and growth state of B16 cells, lymphocytes and rat smooth muscle cells (VSMC) after the phase contrast microscope.
Result锛

本文编号：2000032