iRGD介导的阿霉素—树枝状聚合物抗脑质瘤的比较研究

发布时间：2018-06-12 02:50

本文选题：肿瘤渗透性多肽 + iRGD　；参考：《复旦大学》2014年硕士论文

【摘要】：肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一,具有高发病率和高死亡率的特点。常规的治疗方案包括手术切除、放疗或化疗,但是均难以取得理想的治疗效果。除传统的化疗药物之外,近年来临床上已经开始应用肿瘤靶向治疗药物,包括小分子靶向药物和纳米药物。与传统化疗方法相比,靶向药物具有更强的治疗效果和更小的毒副作用。但是目前应用的靶向治疗药物也存在一定的缺陷,比如药物在肿瘤组织中的渗透能力较弱,不能到达深层的肿瘤组织实质。iRGD (internalizing RGD, CRGDK/RGPD/EC),又称为内化RGD,是近年来研究的一个热点,与传统RGD相比,具有更强的肿瘤渗透能力。本课题组在前期的研究中,以PEG化聚酰胺-胺树枝状聚合物(PEG-PAMAM)为骨架材料,阿霉素(Doxorubicin,DOX)为模型药物,通过酸敏感的顺式乌头酸酐(Cis-acotonic anhydride, CA)与聚合物共价结合,制得PEG-PAMAM-cis-aconityl-DOX (PPCD)复合物,并以RGD (Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys)为主动靶向头基,进行共价修饰,制得主动靶向RGD-PEG-PAMAM-cis-aconityl-DOX (RGD-PPCD)纳米复合物递药系统,研究显示具有较好的抗肿瘤效果。本课题将以iRGD替代RGD,合成iRGD-PEG-PAMAM-cis-aconityl-DOX (iRGD-PPCD)纳米复合物递药系统。考察与传统RGD介导的复合物相比,iRGD介导的PPCD(包括iRGD-PPCD以及iRGD与PPCD联合给药)体内外抗肿瘤的优势,并探讨其作用机理。另外,局部给药也是一种增加药物在肿瘤组织蓄积的有效途径,本课题组前期制备了DOX、RGD修饰和未修饰PPCD的缓释植入片,本研究将初步探讨其体内外行为,为iRGD-PPCD缓释植入片的研究打下基础。1.本课题首先以双功能的MAL-PEG-NHS (Mw 5000)和iRGD对第四代PAMAM进行共价修饰,得到iRGD-PEG-PAMAM,通过酸酐的氨解反应制备DOX的顺式乌头酸酐衍生物(CAD),经过活化后与iRGD-PEG-PAMAM偶联,制备得到iRGD-PPCD。复合物表征结果表明,iRGD-PPCD中每个PAMAM分子表面偶联有20.5个PEG分子,10.1个iRGD分子和11.9个DOX分子,粒径为20.11±1.07 nm, Zeta电位为2.45±0.25 mV。iRGD-PPCD在pH为4.5、5.5、6.5和7.4的条件下,96h累计释放百分数分别为58.74±3.76%、15.03士2.67%、6.88±1.51%和2.64±0.66%,表明iRGD-PPCD具有酸敏感的释放特征。同时按照本课题组前期的实验方法合成了复合物PPCD和RGD-PPCD,表征结果与iRGD-PPCD基本相一致,为后续的比较研究提供了合理性。2.根据C6,F98,B16,U87四种肿瘤细胞中,C6细胞表达整合素αv和NRP-1受体的量最大,选择C6细胞为体内外研究的细胞模型。偶联RGD或iRGD增强了PPCD对C6的细胞毒性和细胞摄取能力。iRGD-PPCD,RGD-PPCD, PPCD的IC50值分别为0.96M、1.21μM、2.40μM。与PPCD相比,C6细胞对iRGD-PPCD和RGD-PPCD的总摄取分别增加了29%和26%,内吞分别增加了67%和59%。实验结果表明,iRGD-PPCD和RGD-PPCD的细胞毒性和细胞摄取没有显著性差异。此外,iRGD或RGD与PPCD联合给药没有改变PPCD的细胞毒性和细胞摄取量。研究结果还显示,RGD和iRGD均能降低C6细胞对RGD-PPCD和iRGD-PPCD的摄取,表明细胞的吸附和内吞具有配体-受体相互作用。在肿瘤球渗透实验中,与RGD-PPCD相比,iRGD+PPCD和iRGD-PPCD的肿瘤球渗透深度分别从115.0μm增加到144μm和150μm,肿瘤球中间断层药物的荧光强度分别增加了54%和38%,表明iRGD介导的复合物具有更强的肿瘤球渗透能力。3.建立ICR小鼠的C6皮下瘤模型,采用荧光共聚焦显微镜(FCFM) Cell-viZio考察DOX复合物对肿瘤血管渗透性、密度和直径的影响。肿瘤血管渗透性实验表明,不同给药组肿瘤血管的渗透性存在明显差别。空白组和DOX原药组的肿瘤血管渗透性最弱；而PPCD,RGD+PPCD,RGD-PPC D组肿瘤血管的渗透性有一定的增强；iRGD+PPCD和iRGD-PPCD组的肿瘤血管渗透性最强。另外肿瘤血管抑制实验表明,与生理盐水组相比,DOX,PPCD和RGD+PPCD组肿瘤血管密度和平均直径没有显著性改变,而RGD-PPCD给药组有显著性降低,与RGD-PPCD给药组相比,iRGD+PPCD和iRGD-PPCD组肿瘤血管密度分别降低了30.8%和24.0%,平均直径分别降低了29.1%和21.3%。4.以ICR小鼠C6原位脑胶质瘤为模型,对DOX及其复合物的组织分布和药效学等进行评价。药动学实验表明,与DOX原药相比,各复合物均表现出明显的长循环特征,主要表现为AUC、T1/2和MRT显著增加,Vc和CL显著减小。组织分布实验显示,PPCD、RGD+PPCD、RGD-PPCD、iRGDPPCD和iRGD+ PPCD在肿瘤组织的AUC分别是DOX的8.2、8.8、10.5、13.7和14.7倍。其中,iRGD+PPCD和iRGD-PPCD在肿瘤组织的AUC分别是RGD-PPCD的1.4和1.3倍。免疫荧光实验表明,与RGD介导的复合物相比,iRGD介导的复合物能够显著增强药物在肿瘤组织的分布,在瘤内分布范围较广,渗透的区域离血管更远。药效学结果显示,iRGD+PPCD、iRGD-PPCD和RGD-PPCD的中位生存期分别是61天,57.5和43.5天。与R GD-PPCD组相比,iRGD+PPCD和iRGD-PPCD组的生存期分别延长了40.2%和32.2%。HE染色和TUNEL实验表明iRGD+PPCD和iRGD-PPCD治疗组肿瘤细胞核皱缩最为明显,肿瘤细胞数目最少,淡红色胞浆面积最大,细胞间隙最大,诱导肿瘤细胞凋亡的能力最强。5.基于课题组前期研究,以PLGA/PLA/PEG为载体,采用溶剂挥发法,制备了DOX-PPCD和RGD-PPCD的缓释植入片,对其进行了体内外行为的研究。植入片在pH 5.5和pH 7.4 PBS缓冲液中的体外释放实验表明DOX及其复合物的PLGA/PLA/PEG植入片的体外释放行为与释放介质的pH和所载的药物无关。释放曲线由迟释段,快速释放段和平台期组成,其中快速释放段符合零级释药模型。60天内的平均累计释放量为63.4%,表明植入片具有明显的缓释特征。测定释放介质中的游离药物的释放量证实包载在植入片中的DOX复合物仍然保持酸敏感释药特性。采用活体成像实验考查植入片的体内行为。在给药第7d,30d,45d的药物扩散面积分别是开始植入药物时的1.31,1.69和2.26倍,表明药物在体内是不断从植入片中渗透出来,扩散进入肿瘤组织的。本课题构建了iRGD-PPCD纳米复合物递药系统。同时对iRGD及RGD介导的PPCD聚合物的抗肿瘤效果进行比较研究,一系列的体内外试验证实：与传统RGD介导的复合物相比,iRGD介导的复合物能显著增强肿瘤血管的渗透性、抑制肿瘤血管的生长,具有更强的肿瘤渗透能力,从而进一步提高抗肿瘤活性。此外,本课题还初步探讨了局部缓释植入片的体内外行为及其机理。
[Abstract]:In this study , it is an effective way to treat tumor tissue . In addition , it is an effective way to improve tumor tissue accumulation . In addition , it is an effective way to improve tumor tissue accumulation . The results showed that the IC50 values of RGD - PPCD and RGD - PPCD were 58.74 卤 3.76 % , 15.03 卤 2.67 % , 6.88 卤 1 . 51 % and 2.64 卤 0.66 % , respectively .
PPCD , RGD + PPCD and RGD - PPC group D had some enhancement in the permeability of tumor vessels .
The tumor vessel density and average diameter of RGD - PPCD and RGD - PPCD group were significantly decreased compared with those of RGD - PPCD and RGD - PPCD .
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

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