PDE4抑制剂氯比普兰的分析方法及临床前药代动力学研究

发布时间：2018-06-17 01:56

本文选题：LC-MS/MS + 药代动力学　；参考：《南方医科大学》2016年硕士论文

【摘要】：磷酸二酯酶-4 (phosphodiesterase 4, PDE4)作为抑郁症和阿尔茨海默病等疾病的潜在靶点已经研究了二十多年,PDE4抑制剂的开发也为这类疾病的治疗提供一定可能。但由于PDE4抑制剂严重的胃肠道不良反应,如恶心、呕吐等阻碍了这一类药物的进一步研究。如何减轻PDE 4抑制剂的不良反应又同时保持其药理活性是这一类药物开发的难点。本课题组通过对经典的PDE 4抑制剂进行结构改造,成功地合成出了一系列化合物。通过酶活性测试我们从中筛选出了一个具有代表性的化合物,(2-((3'-chloro-6-methoxy-[1,1'-biphenyl]-3-yl) methyl)-6-((2-(2-methoxyphenoxy) ethyl) amino) pyridazin-3 (2H)-one (Chlorbipram,氯比普兰)。前期实验证实：1、氯比普兰在体外实验中对PDE 4具有良好的抑制作用,且在120 min的观察期内比格犬无呕吐反应；2、氯比普兰对不同抑郁模型动物(如急性抑郁模型小鼠、慢性不可预期温和刺激模型大鼠)所表现出的焦虑和抑郁样症状有明显的改善作用；3、氯比普兰能一定程度逆转老年小鼠和由Aβ25-35诱导的AD模型大鼠所表现出的认知功能障碍。因此,氯比普兰具有很好的开发前景。然而一个候选化合物能否脱颖而出,成功上市,除了要依赖于药理毒理学效应,它的药代动力学和组织分布等性质也十分重要。这直接影响到新化合物的用药安全性和可靠性。所以,我们在临床前对药物的药代动力学及组织分布等情况进行系统的研究是非常必要的,它能提供药物在动物体的吸收、转运、分布、代谢和排泄(ADME)等信息,为临床上预测人体内的ADME信息、确定给药剂量等提供参考。本课题主要针对新型PDE4抑制剂氯比普兰进行临床前药物代谢动力学研究,并对剂量与相应的药动参数之间的相关性进行研究,计算口服给予氯比普兰后在动物体内吸收的绝对生物利用度,同时根据所测得的氯比普兰在血浆和脑组织中的分布情况,考察氯比普兰是否可以透过血脑屏障进入脑组织,如若可以,则考虑其在脑内亚区的具体分布情况。一、生物样品中氯比普兰UFLC-MS/MS分析方法的建立本研究建立了灵敏度高、专属性强的超快速液相色谱-串联质谱(UFLC-MS/MS)的分析方法,测定生物样品(昆明小鼠血浆和脑组织、SD大鼠血浆和脑组织)中氯比普兰的浓度。实验选用氯比普兰的类似物ZXI14为内标,乙酸乙酯萃取。采用Waters UPLC Acquity BEH C18柱(2.1mmx50mm,1.7μm),柱温40℃,流动相采用水-甲醇进行梯度洗脱,流速为0.25 mL·min-1,进样量5μ1,分析时间5 min。氯比普兰和ZX114在正离子模式下,选用电喷雾离子源(ESr),扫描方式为多反应监测multiple reaction monitoring, MRM);进一步优化质谱条件后,用于定量的离子通道分别为m/z 492.6→231.3(氯比普兰)和m/z 452.8→191.2(内标,ZX114),响应较强且背景噪音低。在昆明小鼠样品中氯比普兰的分析考察,血浆中的线性范围为0.5-200ng/ml,脑组织中的线性范围为0.25-100 ng/g,均呈良好的线性；日间和日内精密度(RSD)在13.0%以内；提取回收率在78.0%-84.8%之间；基质效应在91.0%-101.5%之间,表明小鼠血浆和脑组织样品中的基质不影响氯比普兰的测定；氯比普兰和内标ZX114的空白血浆加标样品在短期、长期、冻融条件下均稳定,不影响测定。同样,方法所建立的SD大鼠血浆线性范围为0.5-500ng/ml,脑组织样品的线性范围为0.25-100 ng/g,均线性良好；日间和日内精密度(RSD)在11.7%以内；两种样品经乙酸乙酯液液萃取后的提取回收率在77.7%-86.0%之间；基质效应在93.8%-101.8%之间,不影响测定；并且,大鼠血浆和脑组织样品的各稳定性考察均符合要求,说明该方法的稳定、可靠。方法学评价的结果表明,所建立的生物样品中氯比普兰分析方法的专属性、线性范围、精密度和准确度、回收率和基质效应等均符合生物样品的分析要求,且方法简便,灵敏度高,重现性好,可用于各生物样品中氯比普兰的含量测定。二、氯比普兰在昆明小鼠体内的药代动力学和脑组织分布研究实验采用180只健康、成年雄性昆明小鼠,将其分成4组,分别灌胃给予氯比普兰低剂量、中剂量、高剂量(2.4 mg/kg、3.6 mg/kg、5.4mg/kg),尾静脉注射给药0.6 mg/kg,每个时间点5只小鼠,在给药后不同时间点取血和脑组织样本,预处理后,用所建立的氯比普兰分析方法测定不同剂量和不同给药方式下昆明小鼠血浆和脑组织中的药物浓度。建立氯比普兰血药浓度-时间曲线和脑组织浓度-时间曲线,然后采用非房室模型法估算氯比普兰在小鼠体内的药动学参数,通过药动参数计算口服给药后氯比普兰的绝对生物利用度；比较相同给药剂量下血浆和脑组织样品分布曲线图,评价氯比普兰透过血脑屏障的情况。实验结果表明,昆明小鼠单剂量口服氯比普兰(2.4,3.6,5.4mg/kg)后,其在小鼠体内的药代动力学参数Cmax分别为11.3±2.0,28.5±3.5,30.5±7.3 ng/ml; tmax分别为12.0±4.5,15.0,15.0]min; t1/2分别为58.8±29.4,55.9±18.3,96.9±45.3min; AUC0-t分别为635.1±85.5,948.7±179.8,1628.0±270.5ng min/ml。氯比普兰在小鼠体内吸收的相关药代动力学参数与给药剂量基本呈线性相关,如在2.4 mg/kg-5.4 mg/kg范围内,AUC0-t与剂量呈线性相关(R2= 0.991), Cmax也与剂量呈一定的相关性(R2=0.729),这说明该药物在小鼠体内的吸收基本呈线性动力学特征,存在一定的剂量依赖性。小鼠单剂量静注氯比普兰(0.6 mg/kg)后,经过拟合,其在小鼠体内的药代动力学参数Cmax、t1/2、AUC0-t分别为159.6±26.5ng/ml,45.9±5.7min,4172.9±349.0 ng min/ml。通过将口服给药不同剂量的药时曲线下面积AUC0-t与换算后的经静注给药后的AUC0-t相比,计算得到氯比普兰在低剂量、中剂量和高剂量口服给药后的绝对生物利用度分别为3.8±0.4%,3.8±0.8%和4.4±1.0%,生物利用度较低。两种给药方式给予小鼠氯比普兰后,在脑组织中均能检测到分布。单剂量灌胃给予氯比普兰(2.4、3.6、5.4mg/kg)后,同样采用非房室模型法进行估算,在小鼠脑组织中药代动力学参数如下：tmax分别为17±7.6、1-2.2、27±6.7 min；t1/2分别为147.3±39.3、69.2±47.2、81.1±14.0min; Cmax分别为4.73±0.53、4.660±0.78、9.4±0.6 ng/g。小鼠尾静脉注射氯比普兰(0.6mg/kg)后,脑组织中药代动力学参数：tmax为10 min；t1/2为47.2±8.5in; Cmax为83.5±11.0ng/g。这些参数中值得注意的是,单剂量静注氯比普兰(0.6 mg/kg)后,tmax为10 min左右,比在血浆中的达峰时间有所延迟,存在一定的吸收过程,峰值浓度为83.5±11.0 ng.mL-1,提示氯比普兰可以透过血脑屏障。同样的,口服给予三个剂量氯比普兰后,其在小鼠脑组织中均能检测到有分布,且吸收和分布的曲线趋势与血浆中的相一致,再次提示氯比普兰可以透过血脑屏障进入脑组织。三、氯比普兰在SD大鼠体内的药代动力学及脑分区研究实验首先采用18只雄性SD大鼠,将其分成3组,分别口服给予氯比普兰2mg/kg、4mg/kg,静注给药1 mg/kg,在给药后的不同时间点取血,同样用第一部分所建立的分析方法测定大鼠血浆中的药物浓度。建立相应的血药浓度-时间曲线,采用非房室模型法估算大鼠体内的药代动力学参数并计算口服给药后的绝对生物利用度。另取18只雄性SD大鼠,分成3组,3组均口服给予氯比普兰4 mg/kg,分别选取吸收相、消除相和达峰时间共三个时间点处死,在冰上取其海马、前额皮质、纹状体及剩余大脑组织,测定不同部位脑组织中的氯比普兰浓度。结果表明,SD大鼠单剂量口服氯比普兰(2 mg/kg和4 mg/kg)后,氯比普兰在SD大鼠体内的药代动力学参数Cmax分别为14.1±1.3,28.5±5.4 ng/ml; tmax为32.5±6.1,30 min; t1/2分别为175.2±45.6,105.6±38.3min, AUC0-t分别为1973.6±170.1,2866.0±534.9 ng min/ml。单剂量静注氯比普兰(1mg/kg)后,其在大鼠体内的药代动力学参数Cmax、t1/2、AUC0-t分别为394.18±52.47 ng/ml, 37.38±10.0 min and 13885.1±1031.3 ng min/ml。以SD大鼠单剂量静注氯比普兰(1mg/kg)后体内血药浓度-时间曲线下面积为参比,计算口服氯比普兰(2mg/kg、4 mg/kg)后的绝对生物利用度,结果分别为7.1±0.8%和5.0±0.8%。在大鼠脑内亚区分布的结果表明,氯比普兰的确可以进入脑组织,且在前额皮质中与海马中的分布较多,而在纹状体中则相对较少,表明氯比普兰在SD大鼠脑内的分布有一定的靶向性。
[Abstract]:PDE4 inhibitors have been successfully developed for the treatment of depression and Alzheimer ' s disease . In the previous experiment , the inhibition of PDE 4 was observed in the experiment of 1 , 2 - chloro - 2 - chlorobipran in vitro , and the Beagle dogs had no vomiting during the observation period of 120 min .
2 . There was a significant improvement in the symptoms of anxiety and depressive symptoms in different depressive model animals ( such as acute depression model mice , chronic unpredictable mild stimulation model rats ) .
In this study , it is necessary to study the pharmacokinetics and tissue distribution of the new PDE4 inhibitor . The linear range of plasma was 0.5 -200ng / ml , and the linear range was 0.25 -100 ng / g .
Intra - day and day - to - day precision ( RSD ) was within 13.0 % ;
the extraction recovery rate is between 78.0 % and 84.8 % ;
The matrix effect was between 91.0 % and 101.5 % , indicating that the matrix in plasma and brain tissue samples of mice did not affect the determination of chlorpinpran ;
In the same way , the linear range of plasma in SD rats was 0.5 -500ng / ml , the linear range of brain tissue samples ranged from 0.25 to 100 ng / ml , and the linearity was good ;
Intra - day and day - to - day precision ( RSD ) was within 11.7 % ;
the recovery rate of the two samples after extraction with ethyl acetate solution was between 77.7 % and 86.0 % ;
The matrix effect was 93 . 8 % - 101.8 % , which did not affect the assay ;
The results showed that the specific properties , linear range , precision and accuracy , recovery rate and matrix effect of Chlorbipran in Kunming mice were consistent with the analytical requirements of biological samples .
In mice , the pharmacokinetic parameters Cmax , t1 / 2 , AUC0 - t were 159.6 卤 26.5 ng / ml , 45.9 卤 5.7min , 4172.9 卤 349.0 ng min / ml , respectively .
t1 / 2 was 147.3 卤 39.3 , 69.2 卤 47.2 , 81.1 卤 14.0min , Cmax was 4.73 卤 0.53 , 4.660 卤 0.78 , 9.4 卤 0.6 ng / g , respectively .
The pharmacokinetic parameters Cmax , t1 / 2 and AUC0 - t of the rats in SD rats were estimated to be 145.1 卤 1.3 , 28.5 卤 5.4 ng / ml , 175.2 卤 45.6 , 105.6 卤 34.9 ng / ml , respectively . The absolute bioavailability of clopidogrel ( 2 mg / kg , 4 mg / kg ) was calculated at 37.38 卤 10.0 min and 13885.1 卤 101.3 ng min / ml . The results showed that the absolute bioavailability of clopidogrel ( 2 mg / kg , 4 mg / kg ) was 7.1 卤 0.8 % and 5.0 卤 0.8 % , respectively .
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R927;R96

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