人亲环素A抑制剂高通量筛选模型的建立及在微生物药物筛选中的应用

发布时间：2018-06-20 17:49

  本文选题：亲环素A + 环孢菌素A　； 参考：《中国抗生素杂志》2017年10期

【摘要】：目的亲环素A是免疫抑制剂环孢菌素A的胞内受体,与多种重要生理和病理过程密切相关,已经成为如免疫抑制、病毒感染和炎症等多类疾病的重要研发靶点。为了筛选新型小分子CypA抑制剂药物,本研究建立了一个基于荧光偏振方法的CypA抑制剂药物高通量筛选模型。方法应用PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增cypA基因,通过大肠埃希菌系统重组表达CypA蛋白,并利用镍离子螯合亲和层析柱进行蛋白纯化,以FITC标记CsA为示踪剂建立CypA抑制剂的筛选方法。结果 SDSPAGE检测重组表达的CypA蛋白纯度大于95%。经过荧光偏振测定体系中示踪剂FITC标记CsA和重组CypA浓度的优化,确定了最佳的荧光偏振反应条件,使其信号本底比大于2.0,Z'因子为0.71。阳性药CsA能剂量依赖地与荧光标记的CsA竞争结合于CypA,其IC50值为221.3nmol/L。利用建立的筛选模型,对28215个微生物次生代谢产物粗提物进行了初筛和复筛,从中筛选得到43个抑制率大于80%的样品。经液相-质谱方法进一步分析,其中17个真菌的发酵产物中含有环孢菌素类似物。结论本研究采用荧光偏振方法定量测定微生物代谢产物与荧光标记探针竞争结合CypA,可以简单、快捷地进行CypA抑制剂药物或环孢菌素产生菌的高通量筛选,为后期的药物研发奠定基础。
[Abstract]:Objective Cyclophile A is the intracellular receptor of cyclosporin A, which is closely related to many important physiological and pathological processes and has become an important research and development target for many diseases such as immunosuppression, viral infection and inflammation. In order to screen novel small molecular CypA inhibitors, a high throughput screening model of CypA inhibitors was established based on fluorescence polarization method. Methods the cypA gene was amplified from human peripheral blood lymphocytes by polymerase chain reaction. CypA protein was expressed by Escherichia coli system and purified by nickel ion chelating affinity chromatography. Using FITC labeled CSA as tracer, the screening method of CypA inhibitor was established. Results the purity of CypA protein expressed by SDSPAGE was higher than 95%. By optimizing the concentration of FITC labeled CSA and recombinant CypA in the system of fluorescence polarization determination, the optimum conditions of fluorescence polarization reaction were determined, and the signal background ratio was greater than 2.0% Z' factor was 0.71. The positive drug CSA could compete with fluorescent labeled CSA in a dose-dependent manner and its IC50 was 221.3 nmol / L. With the established screening model, the crude extracts of 28215 microbial secondary metabolites were screened and rescreened, and 43 samples with inhibition rate of more than 80% were obtained. Further analysis by liquid phase mass spectrometry showed that the fermentation products of 17 fungi contained cyclosporin analogs. Conclusion in this study, the fluorescence polarization method for quantitative determination of microbial metabolites and fluorescent labeled probes combined with CypA can be used to screen CypA inhibitor drugs or cyclosporin producing bacteria in high throughput. To lay the foundation for the later stage of drug research and development.
【作者单位】： 华北制药集团新药研究开发有限责任公司微生物药物国家工程研究中心河北省工业微生物代谢工程技术研究中心新药筛选石家庄市工程实验室;
【基金】：基金项目:微生物来源药物发酵及分离纯化中试条件建设及质量管理体系建设(No.169676404G)
【分类号】：R91

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本文编号：2045163