钟基因Period1和Period2对神经炎症调控机制的研究

发布时间：2018-06-25 16:15

  本文选题：钟基因 + Per1　； 参考：《苏州大学》2015年博士论文

【摘要】：目的:观察钟基因Period1(Per1)和Period2(Per2)在LPS作用下对神经炎症的调控作用,并进一步研究其作用机制。方法:采用小鼠小胶质瘤细胞系BV2细胞,分别对钟基因Per1和Per2进行基因敲减后,使用脂多糖(LPS)100 ng/ml预处理12 h,用ELISA方法检测细胞培养基中的炎症相关因子TNF-α和IL-6的释放量,使用NO试剂盒检测了NO的含量;用免疫印迹方法检测细胞中炎症相关蛋白iNOS和COX2的表达。使用Per1和Per2基因敲除鼠,分别在侧脑室注射2μg LPS,建立在体神经炎症模型,6 h后取鼠脑,提取RNA。使用实时荧光定量PCR(q-PCR)的方法检测炎症的相关因子IL-6,TNF-α、i NOS和COX2的m RNA水平。侧脑室注射2μg LPS 7天后取鼠脑,进行抗GFAP的免疫荧光法染色,检测Per1和Per 2基因敲除对鼠脑星形胶质细胞激活的影响。为了进一步证实Per1和Per2对神经炎症的作用,取新生Per1和Per2基因敲除鼠原代星形胶质细胞进行培养,培养成功后予以LPS 100 ng/ml刺激24 h,取细胞培养基用ELISA方法检测炎症相关因子TNF-α和IL-6的释放;同时用免疫印迹方法检测细胞中炎症相关蛋白iNOS和COX2的表达。为了探讨钟基因Per1和Per2对神经炎症产生影响的作用机制,使用了Per1、Per2基因敲除鼠的原代星形胶质细胞给予LPS100 ng/ml刺激后用免疫印迹方法检测NF-κB通路中p65和IκBα的表达,并且使用免疫荧光技术检测了p65核转位情况;使用核质分离技术检测Per2基因敲减的BV2细胞在LPS刺激后细胞质和细胞核内p65的蛋白含量。结果:与对照组相比,Per1基因敲减的BV2细胞在LPS刺激12 h后,细胞培养基中释放TNF-α和IL-6的量明显减少,NO的含量明显降低;细胞中激活i NOS和COX2的表达也显著减少。Per2基因敲减的BV2细胞在LPS刺激下细胞培养基中释放的TNF-α和IL-6显著升高,NO的含量明显上升。细胞中激活的i NOS和COX2的表达明显增加。与野生型鼠相比较,LPS作用下Per1基因敲除鼠脑中IL-6、TNF-α、i NOS和COX2的m RNA水平显著降低;Per2基因敲除鼠脑中IL-6、TNF-α、i NOS和COX2的m RNA水平显著升高。抗GFAP免疫荧光结果显示,Per1基因敲除能够抑制LPS诱导鼠脑星形胶质细胞的激活,在局部皮层和纹状体区域抑制作用较明显;而Per2基因敲除能够显著增加LPS诱导鼠脑星形胶质细胞激活的反应,在局部皮层与纹状体区域增强星形胶质细胞激活反应尤其明显。在原代星形胶质细胞模型中,与野生型鼠的原代星形胶质细胞相比较,在给予了LPS刺激后Per1基因敲除鼠的原代星形胶质细胞培养基中TNF-α和IL-6的含量显著降低,同时细胞中i NOS和COX2的表达也下降。而在Per2基因敲除鼠的原代星形胶质细胞中,释放到细胞培养基中的TNF-α,IL-6的含量显著提高,同时细胞中i NOS和COX2的表达也明显增加。在对机制的研究中发现,与野生型鼠相比较,Per1基因敲除鼠原代星形胶质细胞在LPS的诱导下,随着时间的延长,p65的表达量减少。Per2基因敲除鼠原代星形胶质细胞中加入LPS后p65的表达不变,但是IκBα的蛋白量在给予LPS后显著减少;同时在LPS刺激30 min后,免疫细胞学实验发现原代星形胶质细胞中的核内的p65相比较野生型鼠明显增加,同时BV2细胞的核质分离实验发现,Per2基因敲减的细胞核中p65的量显著增加,而细胞质中p65的量则显著减少。结论:钟基因Per1的缺失可以显著抑制LPS诱导的神经炎症反应,其作用机制可能与细胞中p65的含量减少相关。钟基因Per2的缺失可以显著增加LPS诱导的神经炎症反应,其作用机制是在LPS刺激下,钟基因Per2缺失能促使NF-κB通路中IκΒα的降解,从而促进了p65向细胞核内转运,最终使炎症因子转录释放增多,促进了LPS诱导的炎症反应的发生。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of the expression of cytokines IL - 6 , TNF - 伪 , i - NOS and COX2 in the cells of rat brain by using the method of immuno - blotting . The expression of TNF - 伪 and IL - 6 in the cells was detected by ELISA . The expression of TNF - 伪 and IL - 6 in primary astrocytes after LPS - stimulated knock - out could significantly increase the expression of TNF - 伪 and IL - 6 in primary astrocytes after LPS stimulation .
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965

【共引文献】

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本文编号：2066686