新型纳米分子HPPS-mAb的构建、靶向TfR肿瘤显像及其输送siRNA研究

发布时间：2018-06-29 15:23

  本文选题：TfR + 抗体　； 参考：《华中科技大学》2016年博士论文

【摘要】：[背景及目的]恶性肿瘤的传统治疗主要依然是手术及放化疗。传统的放化疗在杀死肿瘤细胞的同时,对其他器官的正常组织细胞也产生极大的损害,产生的毒副作用不利于患者的预后及生存质量。靶向治疗相对于传统的肿瘤治疗,不会损伤正常的组织细胞,毒副作用更小。靶向纳米医学旨在改善治疗药物的生物分布,增加全身应用时药物在靶部位的蓄积。靶向治疗的关键点之一是选择肿瘤特异性的靶点。转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)是肿瘤细胞相对特异性的表面标志,其高表达与肿瘤分级分期及预后密切相关。TfR的高表达、胞外段易触及其受体介导的内吞途径使其成为抗肿瘤靶向治疗中的热点靶点之一。课题组前期研究证明,抗TfR单克隆抗体可以高效识别肿瘤细胞,与化疗药物协同作用对于多种不同组织来源的肿瘤细胞具有良好的抗瘤效应,然而其抗体单独应用抗瘤效应相对较低。本课题设计,利用抗TfR抗体能与肿瘤细胞表面的高表达的TfR结合的特点,构建新型纳米靶向分子HPPS-mAb,鉴定其与肿瘤细胞的结合特异性和其生物学活性,为肿瘤的靶向定位、显像示踪和靶向治疗研究奠定基础。本研究通过设计抗体连接长循环的纳米载体,达到主动靶向肿瘤细胞的目的,同时希望解决目前靶向研究中存在外周血“拦截”、非特异性吸收和生理性屏障等难题。研究选用仿HDL脂蛋白纳米颗粒HPPS,具有粒径可控、生物相容性好、免疫原性低等优点。小分子干扰RNA(siRNA)能够通过特异性沉默某基因发挥抗瘤作用,然而其相对较大的分子量、聚阴离子的性质、易被酶促降解,且体内难以输送到细胞内,限制了其体内应用。基于此,本研究在TfR抗体靶向研究基础上,利用胆固醇修饰的siRNA可以高效偶联在HPPS磷脂分子层这一特点,设计构建新型纳米靶向分子HPPS-mAb,具有靶向高表达TfR肿瘤细胞的特性,将携带的治疗性siRNA特异性定位肿瘤组织并与肿瘤细胞结合,通过受体介导的内吞途径介导siRNA释放入胞浆,执行RNAi,从而起到肿瘤显像与杀伤肿瘤双重效应,且可发挥HDL多肽-脂质纳米载体HPPS荧光纳米显像特性。通过研究为靶向肿瘤分子显像与抗瘤效应探索新的思路,对肿瘤的靶向显像与靶向治疗新途径的探索具有十分重要的意义。[方法]1.TfR单克隆抗体在肿瘤细胞HepG2、稳转细胞CHO-hTfR中靶向特异性的鉴定选择不表达人TfR的CHOvec及CHO细胞,高表达TfR的肿瘤细胞HepG2、稳定表达人TfR的CHO-hTfR细胞,采用流式细胞术(FCM)检测抗TfR单克隆抗体与细胞的结合；采用激光共聚焦显微镜技术分析上述细胞与TfR mAb的结合特异性,并与TfR的天然配体Tf进行对比。2. TfR mAb在活细胞中内吞途径的动态观察以稳定表达hTfR的CHO-hTfR为细胞模型,利用共聚焦显微镜技术观察TfR mAb与TfR结合后介导内吞的循环路径,同时固定观察不同的循环时间点,与早期内体与晚期溶酶体的共定位情况,比较其与天然表达的TfR介导内吞途径的差异。3. HPPS-TfR mAb的构建、纯化及表征鉴定利用抗体的-SH修饰方法将HPPS与mAb进行偶联,构建完成的靶向-IPPS-mAb纳米颗粒经FPLC纯化及鉴定；同时进行相关粒径及Zeta电位的表征检测。4. HPPS-mAb体外TfR靶向功能鉴定1μM DIR-BOA的纳米颗粒HPPS-mAb与CHO-TfR共孵育,采用激光共聚焦显微术观察其在细胞内与TfR的共定位;不同浓度的HPPS及HPPS-mAb分别与多种肿瘤细胞系共孵育,流式细胞术检测细胞内DIR-BOA的荧光强度变化,以此表征细胞对纳米颗粒的摄取;相同数量的不表达hTfR的CHO与稳定表达hTfR的CHO-hTfR细胞混合后,与同等浓度的HPPS与HPPS-mAb共孵育,流式细胞术检测CHO-hTfR细胞对HPPS-mAb的特异性摄取。5. HPPS-Isotype的功能鉴定及HDL对纳米颗粒的抑制作用检测构建HPPS-Isotype作为HPPS-mAb的同型对照,比较包括HPPS在内的三种纳米颗粒被细胞摄取的情况：同时利用HDL封闭HepG2细胞的表面SR-BI受体,流式细胞术检测对纳米颗粒的抑制作用。6. HPPS-mAb在U87裸鼠荷瘤模型中靶向聚集效应检测建立U87细胞的裸鼠移植瘤模型,将含10nmol DIR-BOA的HPPS/HPPS-mAb两种纳米颗粒经尾静脉注射进小鼠体内,注射后3小时、12小时、24小时、48小时、72小时采用活体荧光成像系统分别检测小鼠全身的DIR-BOA荧光分布。7. HPPS-mAb在CHOvec/CHO-hTfR双侧裸鼠荷瘤模型中靶向聚集效应检测建立双侧移植瘤模型,左侧为不表达hTfR的CHOvec细胞荷瘤模型,右侧为稳定表达hTfR的CHO-hTfR细胞荷瘤模型,经尾静脉注射HPPS-mAb,在不同的时间点观察纳米颗粒在两瘤体部位的聚集情况,比较两不同瘤体的时间聚集效应；分离瘤体制备成单细胞悬液,检测瘤细胞对纳米颗粒的摄取。8. HPPS-mAb/siRNA诱导HepG2细胞survivin分子的基因沉默效应检测不同浓度的chol-si-survivin与chol-si-NC进行混合后与HPPS-mAb共孵育,构建成HPPS-mAb/siRNA纳米颗粒；不同浓度的siRNA的HPPS-mAb/siRNA处理HepG2细胞48小时,检测其对细胞内survivin mRNA表达的沉默作用。9. HPPS-mAb/siRNA诱导HepG2细胞survivin分子蛋白水平沉默效应及细胞凋亡检测不同浓度的HPPS-mAb/siRNA处理HepG2细胞48小时,Western blot检测其对细胞内survivin分子蛋白水平的沉默作用：利用Annexin V/PI双染法检测HPPS-mAb /siRNA诱导HepG2细胞48h的细胞凋亡效应。[结果]1.TfR mAb与细胞表面TfR的结合特异性流式细胞术检测TfR mAb与肿瘤细胞表面TfR结合的阳性率,结果表明,稳定表达hTfR的CHO-hTfR细胞与TfR mAb的结合阳性率(99.3%)与天然高表达TfR的HepG2细胞(99.03%)没有明显差异,提示CHO-hTfR细胞可稳定表达人TfR,且高表达,可作为细胞模型研究受体介导的内吞作用；而不表达人TfR的CHO和CHOvec细胞与TfR mAb结合率低于5%;激光共聚焦显微术结果可见,PE标记的mAb可以与HepG2及CHO-hTfR结合,并且与TfR-EGFP有共定位,其结合特性与TfR天然配体Tf无明显差异,但PE标记的mAb与CHOvec无结合,提示CHO和CHOvec均可作为细胞模型对照研究。2. TfR mAb在CHO-hTfR中的内吞动态及其胞内定位激光共聚焦显微术对CHO-hTfR的活细胞实时成像结果表明,PE标记的mAb与TfR-EGFP结合后,即可触发TfR介导的内吞途径：细胞表面均匀分布的荧光出现“颗粒化”现象,继而向胞内移动,并进一步向核周移动；20rmin时间点,一部分小囊泡结构失去了EGFP荧光；进一定通过胞内定位可见,早期黄色荧光与内体标志EEA-1有共定位,在30mmin时,TfR-mAb复合体与溶酶体标志分子LAMP-1有共定位。结果表明,mAb触发的TfR介导的内陷化基本符合天然表达的TfR介导的内吞途径,但又有其自身特点。3.靶向纳米颗粒HPPS-mAb的构建、纯化及其表征鉴定改造的HPPS纳米颗粒由华中科技大学武汉光电国家实验室生物医学光子学功能实验室合成,TfR mAb经-SH修饰后,与改造后的HPPS发生反应,偶联在HPPS纳米载体的表面：经FPLC纯化,收集偶联成功的纳米颗粒；经纯化后的靶向纳米颗粒HPPS-mAb纯化曲线结果表明,偶联完成后TfRmAb的保留时间明显提前,峰值与HPPS也有明显区别,说明mAb已与HPPS偶联。进一步经粒径检测仪检测纳米颗粒的粒径,可知HPPS-mAb约为29nnm,其尺寸略大于未偶联的HPPS。4. HPPS-mAb可以经TfR介导内吞进入细胞,并且TfR的偶联可以促进多种肿瘤细胞对纳米颗粒的摄取HPPS-mAb与CHO-hTfR共孵育后,激光共聚焦显微镜技术观察可见HPPS的标记荧光DIR-BOA与TfR-EGFP有共定位,表明HPPS-mAb的摄取由TfR介导内吞完成。当不同浓度的HPPS与HPPS-mAb作用于HepG2时,相同的作用浓度,HPPS-mAb表现出更高的摄取；当作用于其他多种肿瘤细胞系时,HPPS-mAb表现出不同的靶向促进作用,HPPS-mAb的摄取是HPPS的2-5倍不等。5. HPPS-mAb在混合细胞中靶向功能的鉴定相同数量的CHOvec与CHO-hTfR细胞混合后,分别于HPPS及HPPS-mAb共孵育,结果表明,HPPS-mAb可以被特异地递呈进入TfR+的CHO-hTfR细胞中,并随着TfR表达强度的增加,HPPS-mAb的摄取越高。6. HPPS-Isotype的功能鉴定及HDL对纳米颗粒的抑制作用检测构建HPPS-mAb的同型对照Isotype有利于更好地在体内进行HPPS-mAb的靶向显像研究。HPPS-Isotype对于细胞的摄取与HPPS没有明显区别,远低于HPPS-mAb的摄取：当人HDL用于抑制HepG2表面的SR-BI受体时,细胞对HPPS-Isotype的摄取作用被抑制,而对HPPS-mAb仅起到了部分抑制的作用,再次提示TfR与SR-BI双靶向机制的存在。7. HPPS-mAb在U87裸鼠移植瘤模型中的体内靶向显像通过体内显像检查纳米颗粒的长循环周期特性,结果表明：随着时间延长,瘤体部位的蓄积效应越强,48小时达到顶峰;HPPS在全身荧光分布比HPPS-mAb更加广泛,提示HPPS-mAb利于向肿瘤聚集,降低其他器官的聚集效应。8. HPPS-mAb在双侧裸鼠移植瘤模型中的体内靶向显像进一步构建了双侧移植瘤模型进行HPPS-mAb的体内靶向鉴定,结果表明,在早期时间点24小时以前,HPPS-mAb更倾向于聚集在稳定表达hTfR的CHO-hTfR荷瘤侧,而HPPS-Isotype在双侧的蓄积没有明显差异。9. HPPS-mAb/siRNA诱导HepG2细胞survivin分子的基因沉默效应不同siRNA浓度的HPPS-mAb/siRNA作用于HepG2细胞48h,RT-PCR检测其细胞内Survivin mRNA表达水平变化,结果表明,在chol-si-survivin在400nM时,HPPS-mAb/siRNA明显抑制survivin mRNA的表达,沉默效率达62%;HPPS-Isotype/siRNA也起到了一定的基因沉默,但其作用程度低于HPPS-mAb/siRNA,沉默效率低于50%。10. HPPS-mAb/siRNA诱导HepG2细胞survivin蛋白表达的沉默效应及细胞凋亡效应不同浓度的HPPS-mAb/siRNA作用于HepG2细胞48h,WB检测细胞survivin蛋白表达水平变化,结果表明,当siRNA作用浓度达400nM时,HPPS-mAb/siRNA明显降低了细胞survivin表达水平,为未处理组的35.2%。流式检测48h对HepG2细胞诱导细胞凋亡的作用,表明siRNA作用浓度400nnM组,HepG2产生了明显的细胞凋亡,早期凋亡达19.7%。[结论]本课题在TfR抗体靶向研究基础上,设计构建了TfR新型纳米颗粒HPPS-mAb,并探讨了其在体内外靶向TfR肿瘤显像及其输送siRNA的作用。研究发现：①TfR介导mAb内吞研究发现,TfR-mAb复合物的内吞途径与Tf-TfR循环不完全一致,亦不同于铁剥夺类抗TfR抗体触发的TfR降解途径,有其自身特点,作为靶向配体应用于纳米载体的递呈,能够高浓度蓄积在靶部位;②HPPS-mAb在体外能够被肿瘤细胞高效摄取；mAb的偶联明显促进了细胞对纳米颗粒HPPS的摄取：HDL能够抑制HPPS的摄取而对HPPS-mAb仅有部分抑制作用,提示新型靶向纳米颗粒HPPS-mAb对细胞具有双靶向作用机制;③新型靶向纳米颗粒HPPS-mAb体内显像时,24小时内,HPPS-mAb在双侧成瘤模型中更倾向于聚集在高表达hTfR的CHO-hTfR鍢荷瘤模型中,提示将HPPS-mAb应用于肿瘤早期显像诊断的可能性。④利用胆固醇修饰的siRNA可以高效偶联在HPPS磷脂分子层这一特点,我们成功构建HPPS-mAb/siRNA纳米颗粒,将HPPS-mAb作为TfR导向的靶向survivin的纳米载体,证明其在体外对高表达survivin细胞的mRNA及蛋白具有沉默作用,并可诱导肿瘤细胞凋亡,进而为TfR介导的新型纳米分子HPPS-mAb靶向肿瘤分子显像与抗瘤效应研究奠定了良好的基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96

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本文编号：2082545