新的肿瘤抗原OVA12的生物学功能和致瘤机制研究

发布时间：2018-08-11 09:41

【摘要】：肿瘤抗原OVA12是本实验室应用SEREX(Serological analysis of recombinant cDNA expression library)方法从人卵巢癌cDNA表达文库筛选得到的一个新的CT(cancer/testis)抗原。前期研究表明,OVA12抗原在多种肿瘤组织和肿瘤细胞株中高表达,在正常组织(睾丸除外)及正常细胞株中不表达或低表达;将OVA12基因转染SMMC-7721细胞后,细胞增殖速度加快,裸鼠体内成瘤能力增强。结果显示OVA12与肿瘤的发生发展存在密切的关联,因此对OVA12生物学功能和作用机制的深入研究有着重要的理论意义和临床应用价值。本课题主要从以下三个方面进行研究:1)从mRNA及蛋白水平检测多种正常和肿瘤细胞及组织中OVA12的表达水平,明确其表达谱特征;应用病毒感染的方式构建OVA12稳定高表达及干扰细胞株,通过体内外实验进一步探讨OVA12在肿瘤发生发展中的生物学功能。结果显示OVA12在多种肿瘤组织和细胞株中高表达,而在正常组织和细胞中不表达或低表达。体内外结果证实OVA12在肿瘤细胞株高表达或者干扰后能够显著促进或抑制肿瘤细胞增殖能力及抗凋亡能力,并能通过上调Mcl-1和survivin蛋白的表达增加肿瘤细胞对5-FU的耐药性;2)以OVA12稳定高表达和干扰细胞株为研究对象,检测与细胞增殖、凋亡密切相关的信号分子的表达变化。结果显示OVA12表达降低能够显著提高p53蛋白的表达,而OVA12高表达能够抑制p53蛋白的表达,但不影响p53 mRNA水平;与对照组相比,p53荧光素酶基因报告系统检测显示OVA12干扰细胞株p53转录活性明显增加,而OVA12高表达细胞株其转录活性显著降低。OVA12能够调控p53蛋白的K48位多聚泛素链形式,促进p53在蛋白酶体的泛素化降解,并能够影响肿瘤细胞对抗肿瘤药物顺铂(依赖p53信号通路诱导肿瘤细胞凋亡)的敏感性。结果提示OVA12蛋白能够负向调控p53蛋白;3)利用特异性的p53 shRNA干扰阻断p53信号通路,应用CCK-8等相关体内外实验方法检测p53蛋白表达降低后对OVA12生物学功能的影响,同时检测调控p53信号通路上游的多个重要蛋白表达变化,探讨OVA12调控p53信号通路的作用机制。结果显示与对照组相比,在OVA12干扰细胞株内,特异性阻断p53信号通路能有效的逆转OVA12表达降低所导致的细胞增殖能力降低、G1/S期阻滞等生物学行为,体内裸鼠成瘤实验与体外实验结果一致,证实OVA12发挥其生物学功能依赖于p53信号通路;OVA12能够影响肿瘤抑癌基因p14ARF的表达,促进MDM2从细胞核到细胞浆的输出,增强MDM2和p53的相互作用,加速p53蛋白的降解。上述一系列结果表明,OVA12蛋白是一种在肿瘤组织中呈特征性高表达的CT抗原,具有促进肿瘤细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用;提示OVA12通过负向调控p53信号通路作用机制发挥其生物学功能。
[Abstract]:Tumor antigen OVA12 is a new CT (cancer/testis) antigen selected from cDNA expression library of human ovarian cancer by SEREX (Serological analysis of recombinant cDNA expression library) method in our laboratory. Previous studies have shown that OVA12 antigen is highly expressed in various tumor tissues and tumor cell lines, but not expressed or low in normal tissues (except testis) and normal cell lines. After transfection of OVA12 gene into SMMC-7721 cells, cell proliferation rate is accelerated. The tumorigenic ability of nude mice was enhanced. The results show that OVA12 is closely related to the occurrence and development of tumor, so it has important theoretical significance and clinical application value to further study the biological function and mechanism of OVA12. In this study, we studied the following three aspects: (1) detect the expression of OVA12 in various normal and tumor cells and tissues from the mRNA and protein levels, and clarify the characteristics of OVA12 expression profile; The stable high expression and interfering cell line of OVA12 were constructed by virus infection, and the biological function of OVA12 in tumorigenesis and development was further studied by in vivo and in vitro experiments. The results showed that OVA12 was highly expressed in various tumor tissues and cell lines, but not expressed or low in normal tissues and cells. The results in vitro and in vivo confirmed that OVA12 could significantly promote or inhibit the proliferation and anti-apoptotic ability of tumor cells after high expression or interference. It can increase the drug resistance of tumor cells to 5-FU by upregulating the expression of Mcl-1 and survivin protein. The stable high expression of OVA12 and interfering cell lines were studied. The expression of signal molecules closely related to cell proliferation and apoptosis were detected. The results showed that the decreased expression of OVA12 could significantly increase the expression of p53 protein, while the high expression of OVA12 could inhibit the expression of p53 protein, but did not affect the level of p53 mRNA. Compared with the control group, p53 luciferase gene reporting system showed that the OVA12 interference cell line p53 transcription activity was significantly increased, while the transcription activity of OVA12 high expression cell line decreased significantly. OVA12 could regulate the K48 position polyubiquitin chain form of p53 protein. It can promote the degradation of p53 in proteasome and affect the sensitivity of tumor cells to cisplatin (which is dependent on p53 signaling pathway to induce apoptosis). The results suggest that OVA12 protein can negatively regulate p53 protein 3) by using specific p53 shRNA interference to block p53 signaling pathway, and CCK-8 and other related methods in vitro and in vivo were used to detect the effect of p53 protein expression on the biological function of OVA12. At the same time, the expression changes of several important proteins in the upstream of p53 signaling pathway were detected, and the mechanism of OVA12 regulating p53 signaling pathway was discussed. The results showed that the specific blocking of p53 signaling pathway in OVA12 interfering cell lines could effectively reverse the biological behaviors such as the decrease of cell proliferation induced by the decrease of OVA12 expression and G 1 / S phase arrest, compared with the control group. The results of tumorigenesis in nude mice in vivo and in vitro showed that the biological function of OVA12 depended on the p53 signaling pathway: OVA12 could affect the expression of tumor suppressor gene p14ARF and promote the output of MDM2 from nucleus to cytoplasm. Enhance the interaction between MDM2 and p53, accelerate the degradation of p53 protein. These results suggest that OVA12 protein is a characteristic high expression CT antigen in tumor tissues, which can promote the proliferation of tumor cells and inhibit cell apoptosis. The results suggest that OVA12 exerts its biological function through the mechanism of negative regulation of p53 signaling pathway.
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96

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本文编号：2176619