过量人血清白蛋白削弱顺铂、依托泊苷抗肿瘤作用及机制研究

发布时间：2018-09-13 16:50

【摘要】：目的人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)的滥用通常是由于相关用药知识的欠缺造成的。在我国,无论是发达地区还是偏远落后地区,这种现象都极为常见。在大多数情况下,HSA常被国人误认为是滋补品,癌症患者也经常选择使用HSA来增强自身免疫力。然而,过度的使用HSA对化疗药物会产生何种影响目前尚不清楚。本研究我们希望:1、病例调查(1)调查HSA在肺癌患者中的使用情况,明确HSA在各大医院的滥用程度。2、在细胞水平检测化疗药物依托泊苷(etoposide,VP-16)和顺铂(cisplatin,DDP)单独使用或分别合并过量人血清白蛋白(Exces sive Human Serum Albumin,eHSA),化疗药物药效学的改变,并探究具体机制(1)在细胞水平检测化疗药物VP-16和DDP单独使用以及分别合并eHSA对人肺癌细胞敏感株A549的细胞毒性作用;(2)采用流式细胞术、细胞克隆形成实验、细胞迁移实验分别检测化疗药物单独使用或分别合并eHSA对细胞凋亡、细胞集落形成、细胞迁移的影响;(3)采用高效液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术检测化疗药物单独使用或分别合并eHSA时细胞内药物浓度的改变;(4)在分子水平探讨eHSA影响化疗药物药效的分子机制。3、在动物水平检测化疗药物VP-16和DDP单独使用以及分别合并eHSA对小鼠肺癌移植瘤疗效的影响,并探究具体机制(1)检测对照组(未处理小鼠)、化疗药物单独用药组及联合eHSA用药组在不同时间点的HSA水平。(2)监测化疗药物单独用药组及联合eHSA用药组小鼠体重的改变;(3)监测化疗药物单独用药组及联合eHSA用药组肺癌移植瘤重量和体积,并分析各组抑瘤率;(4)在动物水平探讨eHSA改变化疗药物药效的分子机制。方法1、病例调查(1)选择两所三级综合性医院2016年1月至2016年4月所有患者包括肿瘤中心、肿瘤内科、肿瘤外科、呼吸内科在内的四个科室所有病例。根据纳入标准:(1)肺癌患者;(2)使用化疗药物VP-16和DDP的其中一种或者两者联合使用。对符合筛查条件的100名患者进行用药调查,调查内容包括患者性别、年龄、肿瘤分期、血清白蛋白水平、化疗药物及HSA使用情况六个方面。2、细胞实验(1)利用CCK-8法检测eHSA对化疗药物的增殖抑制作用的影响稀释VP-16至0、2.5、5、10、20μmol/L;稀释DDP母液至0、1、5、10、15、20μmol/L的工作浓度;HSA用完全培养基溶解配制浓度至10、20μmol/L。进行CCK-8实验,化疗药物作用72h后检验A549细胞的增殖抑制率,在细胞增殖抑制率大于50%范围内选择VP-16和DDP的适宜浓度10μmol/L作为联合用药浓度。选取HSA联合用药浓度10、20μmol/L进行CCK-8实验。根据CCK-8实验结果将实验分为单独用药组:空白组、VP-16组、DDP组、HSA组;联合用药组:VP-16和DDP联合10μmol/LHSA(VP-16/DDP+HSA(10μmol/L))、VP-16和DDP联合20μmol/L的HSA(VP-16/DDP+HSA(20μmol/L))。t检验比较联合用药前后细胞增殖抑制率的差异显著性。(2)流式细胞术(FCM)分析eHSA对化疗药物VP-16和DDP凋亡作用的影响各个药物组分别经药物处理24h和48h后,Annexin V-PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率,比较各单独用药组与联合用药组细胞凋亡率差异显著性。(3)细胞迁移实验测定肿瘤细胞迁移率的改变各药物组处理48h后,用transwell小室进行细胞迁移实验,迁移时间为24h,结晶紫染色后显微镜下观察各药物处理组细胞迁移情况。(4)LC-MS/MS测定eHSA对细胞内化疗药物浓度的影响各药物处理组作用12h后,萃取细胞内药物,比较各组间细胞内药物浓度差别。(5)实时荧光定量PCR(Quantitative real time PCR,q RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)探究细胞内的药物敏感基因突变基因TOP2A和ERCC1m RNA-蛋白表达的改变各个药物处理组作用72h后,提取细胞总RNA进行q RT-PCR实验。提取总蛋白用Western blot方法在分子水平检测药物敏感基因突变基因ERCC1、TOP2A蛋白的表达情况。先将所有处理组用内参的表达量进行上样量标准化后再检测m RNA及目的蛋白表达量,以对照组进行归一,采用one-way ANOVA统计方法,根据方差是否齐性采用可信区间检验法或Dunnett比较各单独用药组m RNA和蛋白的表达与联合用药组间水平差异显著性,以及t检验比较各联合用药组与对应的单独用药组之间m RNA和蛋白表达水平差异显著性。(6)细胞转染实验进一步在分子水平探究eHSA影响化疗药物的具体机制将A549细胞(每孔150000个细胞)接种在6孔板中24小时,分别进行E RCC1/TOP2A干扰(OPTI-MEM500μL+si RNA-mate 1000pmol+对应的si RNA1000pmol)。8小时后得到RNAi A549细胞。将A549细胞和RNAi A549细胞分别用VP-16,DDP,HSA或VP-16+HSA,DDP+HSA组合处理细胞72小时,并收集用于western blot和q RT-PCR实验。将A549细胞(每孔5000个细胞)接种到96孔板中24小时,分别分别进行ERCC1/TOP2A干扰(OPTI-MEM50μL+si RNA-mate100pmol+对应的si RN A 80pmol)。8小时后得到RNAi A549细胞。将A549细胞和RNAi A549细胞分别用VP-16,DDP,HSA或VP-16+HSA,DDP+HSA联合处理72小时,并收集用于CCK-8实验。3、动物实验(1)将小鼠LLC肺癌细胞(1×107个/只)混悬于0.2m L PBS中,皮下注射于小鼠右后肢进行肺癌造模,10天后造模成功。测量小鼠体重和移植瘤体积,选择体重和移植瘤体积相似的72只小鼠进行后续实验,未处理组小鼠作为对照组。所有小鼠分别尾静脉给予不同浓度的HSA(0,1,2,4g/kg/d)。给药3天后,次日内眦取血,检测血清白蛋白水平。将小鼠随机分为12组,每组6只,分别为A组:NS+NS,B组:HSA(1g/kg/d)+NS,C组:HSA(2g/kg/d)+NS,D组:HSA(4g/kg/d)+NS,E组:NS+DDP,F组:HSA(1g/kg/d)+DDP,G组:H SA(2g/kg/d)+DDP,H组:HSA(4g/kg/d)+DDP,I组:NS+VP-16,J组:HSA(1g/kg/d)+VP-16,K组:HSA(2g/kg/d)+VP-16,L组:HSA(4g/kg/d)+VP-16。第四天开始,分别给予2,10 mg/kg/d的DDP/VP-16,共给药18天。自用药开始,每五天测量小鼠体重,监测化疗药物单独用药组及联合eHSA用药组小鼠体重改变。用药结束后(第21天)次日,内眦取血,检测血清白蛋白水平;(2)治疗期间,游标卡尺测量肿瘤的长(L)和宽(W),各组小鼠的移植瘤体积,肿瘤体积计算公式为V=L×W2;(3)剥离并剖开观察各组移植瘤,并对各组离体移植瘤进行称重,计算抑瘤率,分析各组eHSA联合用药前后两药的联合效应,抑瘤率=(1-实验组肿瘤重量/对照组肿瘤重量)×100%;(4)选择A、C、E、G、I、K组的移植瘤检测ERCC1和TOP2A蛋白的表达,将离体移植瘤处理后用BCA检测试剂盒对蛋白进行定量,western blot法检测目的蛋白含量。结果1、病例调查通过调查发现,在符合纳入范围的100名患者中,HSA水平低于35g/L的12例患者均静脉注射HSA 40克;高于35g/L的88例患者中,有24例静脉注射HSA 40克,此部分患者不必要使用HSA的比例高达27.27%。2、细胞实验(1)CCK-8检测结果显示eHSA减弱了VP-16和DDP对A549细胞的增殖抑制作用。VP-16/DDP+HSA(10μmol/L)的增殖抑制率分别是62.49%±1.50%/67.51%±2.58%,VP-16/DDP+HSA(20μmol/L))的增殖抑制率分别是62.10%±2.10%/64.99%±4.99%,联合用药组的增殖抑制率明显低于单独用药组VP-16/DDP(65.20%±5.20%/(73.04%±73.0%)(P0.05);(2)流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡表明,eHSA单独作用几乎不能引起细胞凋亡(1.98%±0.59%、1.81%±0.16%),VP-16和DDP能明显引起细胞凋亡。与VP-16和DDP单独用药相比,eHSA(VP-16 HSA和DDP HSA)能明显降低细胞凋亡,并且这种弱化作用呈剂量依赖性。VP-16单独用药组药物作用24/48h的细胞凋亡率分别为19.70%±0.99%/34.79%±1.92%,而联合用药组VP-16+HSA(10μmol/L)细胞凋亡率分别为13.21%±0.56%/29.19%±1.04%,联合用药组VP-16+HSA(20μmol/L)细胞凋亡率为9.89%±0.68%/22.28%±1.40%(P0.05)。DDP单独用药组药物作用24/48h的细胞凋亡率为31.50%±0.95%/40.15%±0.69%,而联合用药组DDP+HSA(10μmol/L)细胞凋亡率为22.70%±2.21%/35.22%±0.40%,联合用药组DDP+HSA(20μmol/L)细胞凋亡率为17.89%±0.53%/33.28%±1.89%,三者之间差异具有统计学意义(P0.05);(3)与VP-16/DDP单独用药相比,合并eHSA增加了癌细胞的迁移和克隆形成率,同时降低了VP-16/DDP的细胞内药物浓度。Western blot和实时荧光定量PCR检测表明eHSA增强了药物敏感基因突变基因TOP2A和ERCC1的蛋白和m RNA表达;(4)结果表明,在A549细胞中,eHSA显着削弱了VP-16/DDP的抑制作用。然而,在TOP2A和ERCC1 RNA干扰的A549细胞中,eHSA却增强了D DP的抑制作用,同时对VP-16的疗效不产生影响。在A549细胞中,与单独用药组相比,eHSA显著增强TOP2A和ERCC1的m RNA表达。在RNAi A549细胞中,TOP2A和ERCC1的m RNA表达明显降低。在A549细胞中,与单独用药组相比,eHSA增强了TOP2A和ERCC1的蛋白表达。在RNAi A549细胞中,TOP2A和ERCC1的蛋白表达明显降低。这些结果表明TOP2A和ERCC1可能与A549细胞的细胞活力有关。3、动物实验(1)在化疗开始之前,小鼠血清白蛋白水平与HSA补充量呈正相关(HSA(H)HSA(M)HSA(L)NS)。使用化疗药物干预18天后,12个实验组的血清白蛋白水平组几乎相同,表明补充的HSA随时间完全分解代谢。治疗结束时,A~D组小鼠体重逐渐增加,E~H组和I~L组小鼠体重逐渐下降,但E组小鼠的体重略低于F、G、H。同样,I组小鼠的体重略低于J、K、L组,但是各组之间在各个体重监测点鼠重均值差异均没有统计学差异(P0.05);(2)用药结束后,与非化疗组相比各化疗组的移植瘤重量明显降低。DDP治疗组的肿瘤生长抑制率组E,F,G,H分别为44.35%,36.89%,30.92%,29.42%。VP-16处理组I,J,K,L的肿瘤生长抑制率分别为32.41%,28.78%,21.54%,19.83%。由此可以看出eHSA联合用药组(F、G、H组)与相对应的化疗药物单独用药组(E组)相比,移植瘤重量明显增大;eHSA联合用药组(J、K、L组)与相对应的化疗药物单独用药组(E组)相比,移植瘤重量明显增大,差异具有统计学意义(P0.05);(3)用药结束后,化疗药物单独用药组(E组)与eHSA联合用药组(F、G、H组)相比,联合用药组小鼠移植瘤体积有明显增大;同样,化疗药物单独用药组(I组)与eHSA联合用药组(J、K、L组)相比,联合用药组小鼠移植瘤体积有明显增大,并且差异具有统计学意义(P0.05),说明eHSA明显抑制了DDP和VP-16化疗效果;(4)组织病理学结果表明,肿瘤组织在A~D组中表面光滑柔软,时有溃烂发生;在E~L组中,肿瘤组织较为坚硬,表面略有不平,与A~D组相比出血更多;(5)Western blot实验显示与DDP/VP-16单独用药组相比,eHSA显着增强ERCC1和TOP2A蛋白的表达。结论我们的研究结果表明,合并eHSA会削弱化疗药物DDP/VP-16的抗癌作用,其机制可能是通过上调ERCC1和TOP2A表达来调控的。但e HSA不利于肺癌化疗的分子机制需要进行进一步探究。
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【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

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