miR146a通过Smad4参与多柔比星的心肌细胞毒性作用

发布时间：2018-09-19 13:05

【摘要】：目的:探讨miR146a参与多柔比星心肌细胞毒性作用的可能机制。方法:用多柔比星处理大鼠心肌细胞,用CCK-8方法检测细胞活力,用荧光定量PCR检测miR146a的变化,用Western blot检测切割的Caspase 3的蛋白变化。使用常间回文重复序列丛集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的方法,设计针对miR146a的向导RNA,敲除miR146a的表达。用CCK-8方法和Western blot分别检测敲除细胞的活力和Caspase 3蛋白变化。用软件预测miR146a的靶基因,利用荧光素酶系统进行验证。用Western blot检测多柔比星处理后靶基因的变化,以及用Western blot检测敲除miR146a对靶基因变化的影响。结果:多柔比星处理导致大鼠心肌细胞活力降低,切割的Caspase 3水平升高,同时发现miR146a表达升高(3.6倍)。使用CRISPR可有效敲除miR146a的表达,敲除效果显著高于microRNA decoy的效果(88.6%vs 57.6%)。敲除miR146a的细胞用多柔比星处理,miR146a增加不明显(1.08倍),并且敲除miR146a抑制了多柔比星导致的细胞活力降低和Caspase 3升高。经生物信息学及荧光素酶检测证实在大鼠心肌细胞内Smad family member 4(Smad4)是miR146a的靶基因,用多柔比星处理心肌细胞后,Smad4的表达降低。而敲除miR146a后,Smad4的表达升高,用多柔比星处理敲除miR146a的细胞,Smad4的表达变化不明显。结论:大鼠心肌细胞中,miR146a通过调节Smad4的表达参与了多柔比星对细胞的毒性作用。
[Abstract]:Objective: to investigate the possible mechanism of miR146a involved in doxorubicin cardiotoxicity. Methods: rat cardiomyocytes were treated with doxorubicin, cell viability was detected by CCK-8, miR146a was detected by fluorescence quantitative PCR, and the protein of Caspase 3 was detected by Western blot. Using the method of frequent palindrome repeat sequence cluster (clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR), the RNA, wizard for miR146a is designed to knock out the expression of miR146a. The activity of knockout cells and the changes of Caspase 3 protein were detected by CCK-8 and Western blot, respectively. The target gene of miR146a was predicted by software and verified by luciferase system. Western blot was used to detect the change of target gene after doxorubicin treatment, and Western blot was used to detect the effect of knockout miR146a on target gene change. Results: doxorubicin treatment decreased the activity of cardiac myocytes, increased the level of Caspase _ 3, and increased the expression of miR146a (3.6-fold). CRISPR could effectively knock out the expression of miR146a, and the knockout effect was significantly higher than that of microRNA decoy (88.6%vs 57.6%). MiR146a knockout cells treated with doxorubicin did not increase significantly (1.08 times), and knockout miR146a inhibited the decrease of cell viability and the increase of Caspase 3 induced by doxorubicin. Bioinformatics and luciferase detection confirmed that Smad family member _ 4 (Smad4) was the target gene of miR146a in rat cardiomyocytes, and the expression of Smad4 was decreased after treated with doxorubicin. However, the expression of Smad4 was increased after knockout of miR146a, but the expression of Smad4 in miR146a knockout cells treated with doxorubicin had no obvious change. Conclusion: miR146a is involved in the cytotoxicity of doxorubicin by regulating the expression of Smad4 in rat cardiomyocytes.
【作者单位】： 贵州省遵义医学院附属医院;
【基金】：贵州省2013年度遵义医学院联合基金资助项目(黔科合J字CK-898)
【分类号】：R96

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本文编号：2250209