药物代谢酶的生物质谱绝对定量方法发展及其应用研究

发布时间：2018-10-08 20:48

【摘要】：研究目的基于定量蛋白质组学的研究方法，利用液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS），建立测定大鼠和人肝微粒体中药物代谢酶亚型的分析方法，然后通过制备并测定大鼠和人的肝微粒体样本，获得肝微粒体中各药物代谢酶亚型的表达水平数据，同时和传统探针法进行对照，为药物研发和临床安全用药过程中药物代谢酶的研究提供新的途径。研究方案通过对7种大鼠药物代谢酶CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、UGT2B17、UGT2B2和UGT1A1理论胰蛋白酶水解肽段的氨基酸序列的分析，确定能代表各药物代谢酶亚型的特征肽段，人工合成特征肽段标准品；利用液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS），通过优化液相色谱流动相组成、洗脱梯度，离子源等相关质谱参数，采用多反应监测模式，建立针对特征肽段的LC-MS/MS检测方法；通过选择合适的酶浓度和酶解时间并采用固相萃取过程确定肝微粒体样品的制备方法；实验中制备含有肝微粒体基质的溶液，并合成稳定同位素标记的特征肽段，考察基质对建立特征肽段的标准工作曲线的影响；最后，通过测定大鼠肝微粒体样本，得到药物代谢酶表达水平数据。通过对7种人的P450酶CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C9、CYP2C19和CYP2E1的理论胰蛋白酶水解肽段的氨基酸序列进行分析，确定能代表各P450酶亚型的特征肽段，人工合成具有相同序列的稳定同位素标记的特征肽段标准品；利用液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS），采用多反应监测模式，建立针对特征肽段与其稳定同位素标记肽段的LC-MS/MS定量方法；制备并测定12例人肝微粒体样本，得到相关P450酶亚型含量的数据；分别以蟾蜍灵（Bufalin）和咪达唑仑（Midazolam）为探针底物，进行肝微粒体孵育，得到CYP3A酶活性数据，将CYP3A4和CYP3A5酶含量数据和酶活性数据进行相关性分析，考察新的探针底物蟾蜍灵的底物专一性以及所得P450酶含量数据的准确性。设计一种带有酶切位点的稳定同位素标记肽段作为内标。首先考察带有酶切位点肽段的酶解过程。然后以鼠源肝微粒体中药物代谢酶CYP2A1、CYP2D26和UGT1A1为研究对象，以三种不同的形式加入同位素标记内标肽段。考察以三种形式加入内标肽段对测定结果的影响，同时考察了酶解过程时间长短对测定结果的影响。研究结果本研究确定代表大鼠CYP2D3、CYP2C70、CYP2A1、CYP2D26、UGT2B17、UGT2B2和UGT1A1酶的特征肽段序列依次为GNPESSFNDANLR、YIDFVPIPLPR、 VHEEIEQVIGR、 FADIVPTNIPHMTSR、 IILNELAQR、LLDVWTYELPR、SVFDQDPFLLR，用于多反应监测定量的离子对依次为m/z711.1/625.5、665.6/692.4、437.0/345.2、567.2/577.4、535.5/843.5、702.7/964.5、669.1/645.1，用于定量的标准工作曲线依次为y=820x+1560（r=0.9982）、y=904x 733（r=0.9977）、y=1190x 7210（r=0.9985）、y=1170x 3330（r=0.9993）、y=509x 567（r=0.9996）、y=222x 720（r=0.9981）、y=835x 2420（r=0.9969），测得的酶含量依次为11.77、15.80、26.82、18.30、11.47、27.17和17.30pmol/mgprotein。以合成的稳定同位素标记特征肽段作为内标，对UGT1A1进行定量，结果显示，特征肽段与其同位素标记肽段色谱行为与质谱响应一致，在基质溶液中同位素标记肽段线性关系良好，利用标准曲线法和稳定同位素标记肽段作为内标法测得UGT1A1含量分别为17.30pmol/mg protein和18.23pmol/mg protein，两种方法所得结果基本一致，，但以稳定同位素标记肽段作为内标法操作简便，更适用于复杂样品的高通量测定。本研究确定代表人CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A5、CYP2C9、CYP2C19和CYP2E1酶的特征肽段序列依次为YLPNPALQ、FSVTTMR、EVTNFLR、 SLGPVGFMK、 SHMPYTDAVVHEVQR、 HFPLAER、GIIFNNGPTWK，测得酶的平均含量依次为39.3、4.3、54.0、4.6、10.3、3.0和9.3pmol/mg protein；不同P450亚型的表达水平差别较大，同一P450亚型存在明显的个体差异；吸烟个体中CYP1A2的表达水平稍高，其他酶的表达水平稍低；相关性分析结果可知，以蟾蜍灵为底物测得的酶活性数据与CYP3A4含量数据相关性最好，作为CYP3A4底物，蟾蜍灵的专一性比咪达唑仑更强。同时说明，本实验建立的人P450亚型绝对定量方法准确可靠。实验结果表明，当肽段的酶切位点两端分别增加3个氨基酸时，该带有酶切位点的肽段就能够被胰蛋白酶水解。选用带有酶切位点的稳定同位素标记肽段作为内标时，可以提高测定结果的准确度和精密度。适当延长酶解过程的时间，有利于提高测定结果的准确度。通过以上三部分实验，建立了针对药物代谢酶的定量分析方法，为药物相关领域中药物代谢酶的研究提供了新的途径。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R969.1;O657.63

【参考文献】