新型多功能肽类基因载体的设计及综合性能研究

发布时间：2018-10-12 19:46

【摘要】：引起的疾病,以达到治疗疾病的目的。基因治疗已经成为现代生命科学和医学领域最有前景的研究方向之一。近些年发展的RNA干扰技术和基因组靶向编辑技术,特别是最新的CRISPER/Cas9系统为基因治疗提供了革命性技术手段,但是由于基因治疗所要递送的DNA、RNA或寡核苷酸等分子量过大且带有大量负电荷,很难到达靶组织和细胞发挥作用,因此安全、有效的基因递送载体成为了基因治疗的关键。本论文的目的就是设计和合成安全、有效的多肽类基因递送载体。目前临床应用最广泛、最高效的是病毒类载体,但是因为其毒性、免疫源性、致癌作用和难以大规模生产等问题难以克服,科学家们也一直通过设计非病毒载体来解决这些问题。近些年,多肽以其较好的生物相容性、功能多样性和易于合成和修饰等特点成为一类很有发展前景的非病毒载体。在本论文中,我们针对非病毒载体基因递送过程中面临的障碍,如细胞透膜、内涵体逃逸、进入细胞核、体内抗酶降解和疾病组织靶向等问题,利用多肽功能的多样性、易于合成和修饰的特点,寻找能够克服基因递送障碍的功能多肽分子,并将多肽分子这些特点有机地组合在一起,协同发挥作用,最终得到了一系列转染效率高、生物安全性好的新型多功能片段组装的多肽类基因载体。本文主体分为三部分:1、针对非病毒载体所面临的基因的负载、细胞透膜、内涵体逃逸、进入细胞核这几个主要的细胞水平基因递送障碍,进行多功能载体结构设计多肽载体设计包括:透膜肽TAT介导复合物内吞进入细胞;α-螺旋抗菌肽(LLKK)3片段破坏内涵体将DNA纳米复合物释放到细胞质最终进入细胞核;硬脂酸基团在分子内部提供疏水环境可以提高该类多肽的α-螺旋度,使(LLKK)3片段中亮氨酸和赖氨酸分别分布于α-螺旋的两侧,一侧亲水,有利于赖氨酸和质粒DNA结合形成稳定致密的纳米复合物,另一侧疏水,亮氨酸与脂质双层膜融合以提高细胞内吞和内涵体逃逸效率;半胱氨酸的巯基可以发生交联,起到稳定多肽/DNA复合物的作用,避免DNA降解。通过系统的结构设计和功能评价,最终得到了两个高活性、低毒性的多肽基因载体,转染效率与商用脂质体Lipofecatamie 2000相当。另外为了提高肽序列的透膜和体内抗酶解能力,我们还设计了由D型氨基酸组成的多肽载体,其细胞和小动物体内转染活性评价结果表明:细胞转染效率进一步提高了数倍。在实验中,我们用MALDI-TOF质谱对多肽的分子量进行了确认,用圆二色谱仪对多肽的二级结构进行了分析;利用琼脂糖凝胶电泳、动态光散射、透射电子显微镜等方法,对多肽载体的DNA结合能力、多肽/DNA复合物的粒径、zeta电位和表观形貌进行了分析;用流式细胞仪、共聚焦显微镜等技术,对多肽载体的DNA递送能力、内涵体逃逸效率、转染效率和多肽介导DNA复合物进入细胞的机制等进行了研究;并对多肽以及多肽/DNA复合物的安全性分别进行了评价。我们还利用小动物活体成像技术对全D型氨基酸组成的C18-c(llkk)3c-tat(D型氨基酸多肽用小写字母表示)动物体内转染效率进行了评价,结果显示其转染效率与阳性对照Lipofecatamie 2000相当。2、引入组氨酸,进一步增强内涵体逃逸能力的载体结构设计内涵体吞噬是基因递送过程的一个关键障碍,组氨酸能够在酸性的内涵体中不断吸收质子,通过“质子海绵”效应涨破内涵体,基因/载体复合物得以释放至细胞质。在上述肽序列的基础上,我们通过组氨酸替换赖氨酸或加入组氨酸肽片段的方式设计了四个新的多肽载体,通过将组氨酸的质子海绵作用与α螺旋抗菌肽的打孔作用结合,以期达到更高的转染效率。在实验中,我们测试了4个载体的DNA结合能力,多肽/DNA复合物的粒径和在NIH-3T3中的转染活性,结果显示:这四个载体均能很好地结合DNA,并形成粒径较小、形状规则的纳米颗粒,转染效率大大提高。其中最高的C18-C(LLHH)3C-TAT比上一章中活性最高的全D型载体C_(18)-c(llkk)_3c-tat提高了7.8倍,比阳性对照Lipofectamine 2000和PEI 25k Da分别高出21.9倍和17.2倍。由此可见,将组氨酸序列与α螺旋肽适当组合,使前者质子海绵作用与后者的细胞打孔作用叠加,可有效提高DNA转染效率,是一种科学、可行的基因递送载体设计新策略。3、针对转染神经元细胞,透过血脑屏障的载体结构设计以阳离子透膜肽为主的基因递送载体的问题之一是缺乏细胞靶向能力,在全身给药时很难达到理想的治疗效果,特别是脑内疾病。细胞表面有诸多生物大分子,行使与各自配体特异性相互作用的功能。RVG(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)是来源于狂犬病毒糖蛋白的一个29肽,能够与神经元细胞表达的乙酰胆碱受体特异性结合,对神经系统具有很好的靶向能力。本文中,我们利用自然连接反应将RVG29肽与上述设计1、2中的基因载体偶联,靶向神经胶质瘤细胞,尝试设计一种高效、安全转染神经元细胞的载体。实验结果显示,我们合成的RVG-c(llkk)3-tat和RVG-c(llhh)3-tat两个载体仍能很好结合DNA,形成较小粒径的纳米颗粒,对大鼠神经胶质瘤细胞(C6)的转染试验结果表明:转染效率明显高于脂质体Lipofectamine 2000。加入RVG靶向序列与c(llkk)3-tat相比,转染效率大大提高,可见RVG在转染大鼠神经胶质瘤细胞C6细胞时对提高转染效率发挥了重要作用。除了本文正文中重点介绍了三类21个多肽基因载体以外,文中还按照以上的多肽组装策略还合成了34个多功能片段组装的多肽类基因载体,并对其理化性质、结合DNA的能力、基因递送和转染效率进行了评价,由于篇幅所限未在正文中详述。具体如下(附录1、2):1、天然产物桦木酸(Betulinic acid,BA)和齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)作为疏水性基团替换硬脂酸得到2个基因载体,BA-g(llkk)3g-tat和OA-g(llkk)3g-tat,其转染效率与C18-C(LLKK)3C-TAT相当。据报道桦木酸具有抗肿瘤和抗炎活性,在以后的实验中将联合基因治疗对其抗肿瘤效果进行评价。2、在透膜肽N端修饰两个棕榈酸(Palmitic acid,PA)得到PA-K(PA)R9TAT,试图利用疏水作用提高透膜肽的基因转染效率,但实验中发现其内涵体逃逸能力较弱,未能达到理想的转染效果。3、利用HIV-1 gp41蛋白中的融合肽(FP23、HGP、s HGP和PVI等)作为内涵体逃逸功能片段,合成了FP23KR9K-PVI、FP23KR9K-CH6、FP23KR9K-s HGP、FP23KR9K-SV40、Chol-KR9K-s HGP、Chol-KR9K-PVI等多肽载体,但由于其透膜能力较差,造成转染效率较低。4、利用抗菌肽(LLRR)3和pexiganan(pexi)与透膜肽、硬脂酸等进行组合,得到基因载体(LLRR)3和C18-Pex-TAT等,但此类毒性较大,只做了主要指标评价。本文的创新在于:1、利用多肽化合物的结构、功能多样性,选取病毒或细菌的蛋白中对基因递送发挥重要作用的功能多肽,或是根据这些天然多肽的序列和结构特点人工设计多肽,并通过化学合成方法将各功能多肽进行合成和组装;2、研究不同功能多肽的结构特征和组装规律对基因递送的作用,合理地将不同功能的多肽进行组合,使各功能肽段能够协同发挥作用,有针对性的解决基因递送重重障碍;3、通过研究多功能肽类载体与核酸药物的组装规律,来设计多肽基因载体的结构,实现更高的转染效率。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R91

【参考文献】