壳聚糖纳米载体对神经系统影响的研究

发布时间：2018-10-25 17:20

【摘要】：背景：目前关于无机纳米粒的毒性研究很多,而关于有机可降解纳米载体的毒性研究很少。壳聚糖纳米粒作为载体在脑部疾病治疗中应用广泛,并且常用吐温80修饰用于促进脑部递药,然而罕有关于其安全性的研究。本研究对壳聚糖纳米粒、吐温80修饰壳聚糖纳米粒对神经系统的影响进行了研究。方法：1.通过离子凝胶化法制备壳聚糖纳米粒(CS-NPs)、吐温80修饰壳聚糖纳米粒(TmCS-NPs),并对其粒径、电位、形态进行了表征；2.在SD大鼠上评价两种纳米粒的神经毒性,首先采用罗丹明B异硫氰酸酯(RBITC)对壳聚糖进行荧光标记,制备荧光标记的CS-NPs、TmCS-NPs,观察荧光标记的纳米粒在大鼠脑部分布,而后连续七天尾静脉注射高(30mg/kg)、中(10mg/kg)、低(3mg/kg)剂量纳米混悬液,并对主要聚集脑区的氧化应激标志物水平、组织病理学变化及GFAP、NeuN的表达进行了检测,此外,还对大鼠体重变化情况进行统计；3.在斑马鱼胚胎模型上评价CS-NPs、TmCS-NPs的发育神经毒性,首先将胚胎暴露于一系列浓度梯度(5mg/L, 10mg/L,20mg/L,30mg/L,40mg/L,50mg/L) CS-NPs、 TmCS-NPs混悬液,统计各组胚胎死亡率、孵化率及畸形发生情况,并计算两种纳米粒的LC50,以1/2 LC50作为暴毒浓度对CS-NPs、TmCS-NPs暴露后胚胎神经行为及相关机制进行研究,神经行为评价指标包括19～27hpf胚胎自主运动、72hpf幼鱼机械触碰逃避反应、120hpf幼鱼自由游泳活力及光暗周期反应活力测定,机制研究包括胚胎活性氧检测、流式细胞术测定凋亡、吖啶橙染色评价凋亡、苏木精-伊红染色、透射电镜观察幼鱼肌肉形态、整体胚胎免疫组化染色评价初级运动神经元和次级运动神经元轴突的发育。结果：离子凝胶化法制备的CS-NPs、TmCS-NPs平均粒径分别为247±20 nm、251±15nm,制备的纳米粒粒径均一,形态圆整,zeta电位分别为24.4±3.9 mV、26.5±4.2mV。利用RBITC对壳聚糖进行荧光标记,本研究观察了250 nm左右CS-NPs、 TmCS-NPs在大鼠体内分布情况,检测到TmCS-NPs在脑部的荧光信号,而未检测到CS-NPs在脑部的荧光信号,250nm左右TmCS-NPs主要分布在大鼠的大脑皮层和小脑。连续七天尾静脉注射TmCS-NPs后,大脑皮层、小脑的氧化应激反应均不明显,但与空白对照组相比,大鼠体重降低明显,且呈剂量依赖。此外,TmCS-NPs处理后,皮层局部区域神经细胞形态变为梭形,且随着TmCS-NPs注射剂量的增高,神经细胞形态变化越明显。TmCS-NPs暴露还导致小脑GFAP表达降低。这些现象都表明TmCS-NPs具有潜在神经毒性。进一步在斑马鱼胚胎模型上对CS-NPs、TmCS-NPs的发育神经毒性进行了评价。斑马鱼胚胎暴露于一系列浓度梯度CS-NPs、TmCS-NPs混悬液后,胚胎死亡率增加、孵化率降低,且呈剂量依赖。CS-NPs、TmCS-NPs在胚胎上的LC50分别为23.26mg/L、25.06mg/L。 CS-NPs、TmCS-NPs暴露后,观察到幼鱼发生游囊关闭及脊椎弯曲,随着浓度的升高,畸形发生率增加。在相对安全的浓度(1/2 LC50)下,纳米粒暴露可引起胚胎运动行为的紊乱：TmCS-NPs暴露降低了20hpf、21hpf时胚胎的自主运动频率；CS-NPs、TmCS-NPs暴露降低了72hpf时幼鱼的机械触碰逃避反应；CS-NPs暴露增加了120hpf时光周期试验中黑暗周期幼鱼的运动活力。机制研究结果显示,CS-NPs、TmCS-NPs暴露导致胚胎ROS水平升高,但凋亡末见明显变化,纳米粒暴露还导致幼鱼的肌肉肌束溶解、肌细胞核皱缩及线粒体肿胀,抑制幼鱼初级运动神经元、次级运动神经元轴突的发育。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96

【共引文献】