【摘要】：糖皮质激素(Glucocorticoids,GCs)是肾上腺皮质分泌的一种重要的激素,参与了机体多种物质的代谢过程,对维持机体正常的生长发育及内环境的稳态等发挥重要的作用。同时糖皮质激素还具有很强的抗炎、免疫抑制等重要的药理作用,是临床常用的药物。另外,糖皮质激素还是一种参与应激的重要激素。然而大量研究显示,长期反复的应激或大剂量外源性糖皮质激素的给予可使体内GCs维持在较高水平,引起海马神经元的丢失和死亡,与阿尔茨海默症(AD)的发生和发展密切相关。然而,体内高水平的糖皮质激素对海马神经元损伤的机制还尚不完全清楚。第一部分:目的:研究慢性糖皮质激素对原代培养海马神经元NLRP-1炎症小体激活的影响及机制,探讨NLRP-1炎症小体在慢性GCs诱导海马神经元损伤的作用。方法:1.原代培养海马神经元到第5天,随机分成对照组和地塞米松(DEX,5μM)组,各组再分为1d、3d、5d三个时间点。LDH试剂盒检测海马神经元细胞损伤情况;Hoechst 33258染色测定海马神经元凋亡情况;Western blot检测NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的蛋白表达变化;ELISA检测细胞上清液中IL-1β、IL-18的含量变化。2.原代培养海马神经元到第5天,随机分成6组:对照组,DEX(0.1,1,5μM)组,RU486(5μM)组和DEX(5μM)+RU486(5μM)组。LDH试剂盒检测海马神经元细胞损伤情况;Hoechst 33258染色测定海马神经元凋亡情况;免疫荧光检测GR和MAP2表达情况;Western blot检测GR、ASC、NLRP-1、Caspase-1、IL-1β的蛋白表达变化;ELISA检测细胞上清液中IL-1β、IL-18的含量变化;Q-PCR检测NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的mRNA表达变化情况。结果:1.与对照组比较,DEX 5μM处理3、5d能明显促进海马神经元LDH的释放;Hoechst 33258结果显示,与对照组比较,DEX 5μM处理1、3、5d能明显促进海马神经元凋亡,细胞核固缩或裂解呈碎块状;Western blot结果表明,与对照组比较,DEX 5μM处理5d的海马神经元细胞MAP2表达明显下降,DEX 5μM处理1、3d的海马神经元细胞NLRP-1,caspase-1 and IL-1β表达明显增加。2.与对照组比较,DEX 1、5μM处理3d能明显增加细胞上清液中LDH的含量,而RU486可抑制其增加。Hoechst 33258结果显示,与对照组比较,DEX 5μM处理3d导致海马神经元细胞凋亡明显。免疫荧光结果显示,与对照组比较,DEX 1μM和5μM处理5d海马神经元MAP2的表达明显降低;DEX 0.1,1和5μM处理3d能明显减少海马神经元GR的表达。Western blot结果表明,与对照组比较,DEX 0.1,1和5μM处理3d能明显减少海马神经元GR的表达以及明显增加NLRP-1和ASC的表达;DEX 0.1μM处理3d能明显减少海马神经元caspase-1和IL-1β的表达,DEX5μM处理3d的海马神经元caspase-1和IL-1β表达明显增加;DEX 1μM和5μM处理3d可明显下调海马神经元NF-κB的表达;与DEX 5μM组比较,RU486能明显抑制DEX诱导的海马神经元caspase-1和IL-1β表达增高。ELISA结果表明,与对照组比较,DEX 1和5μM处理3d能明显增加海马神经元细胞上清液中IL-1β和IL-18的含量,而RU486能明显减少IL-1β和IL-18的释放。第二部分:目的:研究慢性糖皮质激素对海马神经元BK-NLRP1信号通路的影响,探讨BK-NLRP1信号通路在糖皮质激素诱导海马神经元损伤中的作用,以便为AD的防治提供新的思路和靶点。方法:1.原代培养海马神经元到第5天,随机分成4组:对照组,DEX(5μM)组,Iberiotoxin(IbTx,0.2μM)组和DEX(5μM)+IbTx(0.2μM)组。LDH试剂盒检测海马神经元细胞损伤情况;Hoechst 33258染色测定海马神经元凋亡情况;免疫荧光检测MAP-2蛋白表达的变化;Western blot检测MAP2、BK、NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的蛋白表达变化;ELISA检测细胞上清液中IL-1β、IL-18的含量变化;Q-PCR检测NLRP-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的mRNA表达变化;采用离子选择电极法检测海马神经元细胞内钾离子的浓度;全细胞膜片钳方法观察DEX和IbTx对海马神经元大电导钙激活钾通道(large conductance calcium activated potassium channel channel,BK)电流变化的影响。2.雄性小鼠分为对照组,DEX(5mg/kg)组,各组再分为7d、14d、21d、28d四个时点。Western blot和Q-PCR检测小鼠海马组织中BK mRNA和蛋白表达水平。结果:1.与对照组比较,IbTx能明显减少DEX诱导海马神经元的LDH释放;IbTx也能抑制DEX诱导海马神经元的凋亡。Western blot结果表明,与DEX 5μM组比较,IbTx能明显减少DEX诱导海马神经元NLRP1,ASC,caspase-1和IL-1β的表达。免疫荧光结果显示,与DEX 5μM组比较,IbTx能明显减少DEX诱导海马神经元的MAP2的表达。ELISA结果表明,与DEX 5μM组比较,IbTx能明显抑制海马神经元细胞上清液中IL-1β和IL-18的释放。全细胞膜片钳结果显示,DEX(5μM)可以增大海马神经元BK通道电流大小,降低细胞内钾离子的浓度,IbTx可抑制这一效应。2.Western blot结果显示,与对照组比较,DEX 5mg/kg处理7,21和28天小鼠海马和皮层组织内BK表达明显增加。Q-PCR结果显示,与对照组比较,DEX5mg/kg处理21天和28天小鼠皮层和海马组织内BK表达水平明显增加。结论:1.慢性GCs暴露可能通过下调海马神经元GR表达,激活NLRP-1炎性小体,增加海马神经元的炎症反应和诱导海马神经元损伤。2.慢性GCs诱导的海马神经元损伤可能与上调海马神经元BK通道表达,增加BK通道电流,导致海马神经元[K+]i降低,进而激活海马神经元NLRP-1炎症小体,促进海马神经元损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96
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