【摘要】：脂质是生物体中一类非常重要的化合物。磷脂是一种含有磷酸的脂质,是以甘油三酯,或鞘鞍醇为骨架,结合亲水性的含有磷酸的取代基集团和疏水性的脂肪酸链组成。根据磷酸上不同的取代基和脂肪酸链的多样化构成了不同种类的磷脂类化合物。磷脂可根据骨架的不同分为甘油磷脂和鞘磷脂,甘油磷脂又可根据其头部的不同区分为:磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)等。其中磷脂酰胆碱(phosphatidylcholines,PCs)和溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholines,LPCs)是构成细胞膜的基础成分之一,担负着能量代谢、信号传导以及蛋白质锚定等重要的生理和生化功能。许多疾病中可以看到血浆中磷脂类成分升高,如:代谢综合征、糖尿病、脑梗塞和动脉粥样硬化等。有研究表明,PCs和LPCs还可能通过影响体内药物代谢的酶,如:细胞色素P450酶,从而影响药物的代谢。有研究表明不饱和脂肪酸对UGT酶有抑制作用,推测磷脂类化合物也可以影响UGT酶的代谢。尿苷二磷酸葡醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)家族所催化的葡萄糖醛酸化反应是所有脊椎动物体内清除内源性物质和外源性物质的重要途径之一。UGT酶位于内质网膜上,活性部位朝向内质网腔,作为II相药物代谢的重要酶,它催化的葡萄糖醛酸结合反应占所有药物II相代谢的35%左右。临床上许多重要的药物依靠UGTs家族代谢清除。如:伊立替康的活性代谢产物7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)主要由UGT1A1参与代谢;UGT2B7和UGT2B15在体内参与非甾体类抗炎药的代谢。此外,对内源性物质的代谢也是UGT酶的重要的功能。如:胆红素需要UGT1A1代谢清除,该酶活性降低会影响胆红素体内的清除。体内一些激素也需要UGT酶代谢才能终止活性和作用。某些病理状态下,UGT酶担负着毒性代谢产物的清除,如:胆道梗阻时,血浆中各种胆汁酸的浓度升高,需要UGT酶的代谢清除。因此UGT酶对内源性物质的及时代谢和清除是保持机体内环境稳定的重要因素。在代谢体内内源性物质的同时,UGT酶活性也可以被内源性物质抑制,已经有一些这方面的报道。我们曾经报道过人体胆汁酸对UGT酶的抑制作用。本研究目的是关注另一种内源性物质,磷脂类系列化合物对UGT酶的作用。我们考察考察了28种PCs和14种LPCs对常见的UGT酶的抑制作用。使用已知的UGT酶底物为探针,采用高效液相的方法,考察磷脂类化合物对UGT酶的抑制4作用,并对其中强烈抑制UGT酶的磷脂做抑制动力学分析。结果发现相对于PCs,LPCs更容易对UGT酶产生抑制。并且相对于短链的LPCs,长链的LPCs抑制作用更强。从UGT酶来看,UGT1A6和UGT1A8容易受到磷脂类化合物的抑制。其中进一步做动力学研究明确了PC 16:0 2:0和LPC 15:0对UGT1A6,以及LPC18:0对UGT1A8的抑制属于竞争性抑制。PC 16:0 2:0对UGT1A8,LPC 18:0对UGT1A6属于非竞争性抑制;同时根据测定的抑制常数Ki值,PC 16:0 2:0、是UGT1A8的强抑制剂,LPC 18:0是UGT1A8的弱抑制剂,PC 16:0 2:0、LPC 15:0、LPC 18:0是UGT1A6的中等程度的抑制剂。容易受到磷脂类化合物影响的UGT1A6和UGT1A8是人体内重要的UGT酶:UGT1A6能代谢内源性物质5-羟色胺,还能代谢烟草中的苯并芘类化合物,其活性降低和肺癌的发生相关。UGT1A8能代谢甲状腺激素、雌激素等内源性物质,同时UGT1A8是肠道表达的UGT酶之一,参与构成机体代谢外源性物质的第一道屏障。因此磷脂类成分摄入过多时,可能会影响UGT1A6和UGT1A8参与的体内代谢过程。为进一步探讨磷脂类化合物抑制UGT酶的机制,我们使用了计算机辅助分子对接的手段考察了LPCs和UGT1A6的相互作用。我们知道,受益于人类基因组计划,许多蛋白质的一级序列已经被人类所知。然而,对于蛋白质而言,仅仅知道一级序列对蛋白质的功能的了解和研究是远远不够的,因为蛋白质的功能很大程度上取决于空间构型。由于技术的瓶颈,许多蛋白质的空间构型还不为人所知,例如:UGT1A6。为解决这一问题,我们使用了同源模建的方法,即利用相似度高的已知晶体结构的蛋白,对只知道一级序列但晶体结构未知的蛋白进行模拟,再利用计算机技术对模拟蛋白的键长键角、分子间相互碰撞、自由能等各方面进行优化,得到未知晶体结构的蛋白的空间构象,用于蛋白质的研究。在此基础上,利用计算机技术虚拟蛋白与蛋白之间,蛋白质与小分子之间的相互作用,并给出打分和评价。使用这种技术能够直观的显示分子之间相互作用的位点并由计算机给出相应参数(如:结合自由能等)。能够对分子间相互作用做出科学客观的评价。我们首次使用上述方法构建了UGT1A6的晶体结构,并使用分子对接的手段评价了LPCs和UGT酶的相互作用。发现UGT酶存在LPCs结合位点,LPCs结合后UGT酶后能以长链脂肪酸阻挡另一个天然底物:尿苷二磷酸葡萄糖与UGT酶的结合。从Chemscore打分来看,随着脂肪酸链的增长,其Chemscore打分更优。这提示了含有长链脂肪酸的LPC与UGT1A6结合更好,可能也导致对UGT酶的抑制作用越强,这与试验中长链的LPCs对UGT酶有强抑制的现象相吻合。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
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