促血小板生成因子—重组酪氨酰tRNA合成酶的研制

发布时间：2018-11-17 10:17

【摘要】：血小板减少症(Thrombocytopenia)是临床上的常见病和多发病,肿瘤的放疗、化疗,骨髓移植及慢性肝脏疾病都能诱导产生血小板减少症。当血小板数目降低至20,000/mm3时,就需要进行血小板输注,但血小板的污染及抗体的形成都会影响输血的效果。临床上常用血小板滤器或选择与HLA相同的血小板以减少抗血小板抗体的形成。目前越来越多的研究发现许多细胞因子可以促进血小板的生成,如干细胞因子(SCF)、白介素-1(IL-1)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、白介素-11(IL-11)、白介素-3(IL-3)与粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)的融合蛋白PIXY-321,促血小板生成素(TPO)都开始用于治疗放化疗导致的血小板减少症。这些细胞因子在前期的临床实验中均表现出刺激巨核细胞增殖及促进血小板生成的作用,但在临床试验中,它们的疗效并不尽如人意,出现了很多严重的毒副作用。因而寻找一种更安全有效地提升血小板的药物具有极为重要的意义。许多氨酰tRNA合成酶具有细胞因子功能,其中人酪氨酰tRNA合成酶第341位氨基酸发生突变后具有促进血小板生成的功能。本研究为了证明第341位氨基酸发生突变的重组人酪氨酰tRNA合成酶(rhTyrRS)突变体具有治疗化疗后血小板减少症的作用,将通过三个部分进行实验：一、rhTyrRS (Y341A)的药效学和急性毒性研究。建立小鼠血小板减少模型,通过腹腔注射给药并定期检测小鼠血小板,解剖小鼠后对各组织脏器进行HE染色及观察巨核细胞情况；二、rhTyrRS(Y341A)的作用机理与信号通路。通过M07-e细胞的迁移实验和THP-1与HUVEC细胞的黏附实验分析rhTyrRS (Y341A)促血小板生成的机理。通过免疫荧光实验分析rhTyrRS (Y341A)与和NFκB信号通路的关系。三、rhTyrRS (Y341A)的中试研究。通过中试发酵并纯化得到大量具有生物活性的蛋白,经过一系列质量检定和验证后,制成注射用粉针剂；一、rhTyrRS (Y341A)的药效学和急性毒性研究小鼠连续7天腹腔注射1μg/kg,10μg/kg,100μg/kg剂量的rhTyrRS(Y341A),以5μg/kg TPO为阳性对照,PBS为阴性对照,生理盐水为空白对照,定期剪尾取血分析血小板数目变化。实验第8天通过皮下注射环磷酰胺诱导血小板减少症,持续取血分析血小板数目变化。最后将小鼠解剖后对各脏器进行HE染色观察,用免疫组织化学方法检测巨核细胞在骨髓中的分布。结果显示连续7天注射rhTyrRS (Y341A)后逐渐提升了血小板数目,不同剂量的rhTyrRS (Y341A)对血小板提升呈明显的量效关系。注射rhTyrRS (Y341A)大大降低了环磷酰胺对肝脏等脏器的毒性,降低了血小板减少症的程度及幅度,促进了巨核细胞在血窦附近的聚集并提高了血窦周围巨核细胞占总巨核细胞数目的比例。通过一次大剂量给药方式检测rhTyrRS (Y341A)的急性毒性,结果显示一次注射rhTyrRS (Y341A) (22mg/kg),小鼠未出现死亡,各脏器未见毒副作用。本章中我们初步发现rhTyrRS(Y341A)可用于治疗化疗引起的血小板减少症,其升血小板作用具有量效和时效关系。二、rhTyrRS (Y341A)的作用机理与信号通路根据第一章中rhTyrRS (Y341A)促进了巨核细胞在血窦附近的聚集并提高了血窦周围巨核细胞占总巨核细胞数目的比例的结果,我们采用M07-e细胞的transwell迁移实验和THP-1和HUVEC细胞的黏附实验分析rhTyrRS (Y341A)具有的促细胞迁移和黏附作用。通过RT-PCR,定量PCR和流式细胞方法证明HUVEC细胞表面的VCAM-1是细胞黏附过程中的关键因子。再通过免疫荧光实验探索VCAM-1表达相关的信号通路。实验结果表明rhTyrRS (Y341A)促进了M07-e细胞的迁移和THP-1与HUVEC细胞的黏附。其迁移和黏附作用与rhTyrRS (Y341A)的量具有一定的量效关系,呈钟形曲线分布并以10nnM为顶峰。定量PCR和流式细胞实验表明rhTyrRS促进了HUVEC细胞表面VCAM-1的表达。免疫荧光细胞实验表明rhTyrRS促进了NFκB的入核。在本章中我们发现rhTyrRS (Y341A)可能通过刺激NFκB信号通路来促进巨核细胞的迁移和黏附从而提升血小板。三、rhTyrRS (Y341A)的中试研究为了得到大量具有生物活性的rhTyrRS (Y341A)用于后续药代动力学和药理毒理研究,在实验室摇瓶表达及5L发酵罐优化的基础上,采用30L NBS发酵罐研究发酵工艺的最适参数。大肠杆菌经18小时发酵后离心收集菌体。缓冲液重悬后高压破菌并收集上清,经过阳离子交换层析,凝胶过滤层析,阴离子交换层析后得到纯化的rhTyrRS,经SDS-PAGE、Western-Blot、N端测序、LC/MS、HPLC、内毒素检测和氨酰化活性检测等鉴定后,以甘露醇为辅剂,制成注射用粉针剂。纯化后得到的5g的rhTyrRS(Y341A),蛋白回收率大于25%,产率大于250 mg/L。纯化后的rhTyrRS (Y341A)的N端前15个氨基酸与理论序列一致,蛋白纯度大于95%, LC/MS计算分子量为59.18KDa,与理论分子量一致。氨酰化活性实验和ELISA实验证明rhTyrRS (Y341A)具有蛋白活性和细胞因子活性。在本章中,我们初步建立了注射用rhTyrRS (Y341A)的生产和检定规程,中试工艺较稳定,可线性放大以实现产业化生产
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R943;R965

【参考文献】