肝素衍生物靶向MMPs高表达抗肿瘤侵袭研究

发布时间：2018-11-23 06:54

【摘要】：癌症致死率高,严重威胁着人类的生命健康。导致癌症高致死率的重要原因之一是其的高侵袭和高转移特性。以肝癌为例,手术切除及术后辅助治疗虽一定程度上可延长患者生存期,但由于肝癌的高侵袭和转移特点,其预后较差,复发率高。肿瘤的侵袭转移是一个多步骤的复杂进程,主要过程包括:①肿瘤细胞从原发灶脱离;②肿瘤细胞迁移到血管或淋巴管;③肿瘤细胞穿透血管腔;④逃脱免疫系统;⑤在远处与血管内皮粘附;⑥从血管中溢出到新的组织;⑦在新宿主组织中肿瘤细胞存活并生长。其中,细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)和细胞基底膜(Basement memBrane,BM)的降解涉及到侵袭和转移的多个阶段,是其中的重要步骤之一。正常情况下,ECM和BM是机体中高度有序的屏障结构,主要成分为Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等,其中Ⅳ型胶原为最主要成分。在肿瘤侵袭和转移过程中,肿瘤细胞通过释放多种蛋白水解酶,如基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)和乙酰肝素酶(Heparinase,HPA),降解ECM和BM,促进癌细胞在体内的侵袭和转移。其中,MMPs可降解多种胶原蛋白,在ECM和BM降解过程中发挥着重要作用,近年来已成为抗肿瘤侵袭和转移的热门靶点之一。基质金属蛋白酶MMPs是一类依赖于Zn2+,Ca2+的内肽酶,目前已发现20余种,其在胚胎发育、免疫、血管生成、炎症、肿瘤侵袭及转移过程中均发挥着重要作用。MMPs家族结构具有同源性,均由三个保守序列组成,分别为N端前肽区、催化区和C端血红素结合蛋白样结构域。正常情况下,MMPs在体内表达水平较低,但研究发现,在肿瘤发展进程中,MMPs表达会异常升高,通过降解ECM和BM,促进肿瘤的侵袭和转移过程。MMPs在肿瘤发展过程中发挥着重要的作用。MMPs,尤其是MMP-2、-9,可降解ECM和BM中的多种胶原,使原本隐藏在基底膜的相关位点暴露出来,促进肿瘤细胞的转移。同时,MMPs通过降解ECM,释放贮存在ECM中的多种生长因子促进肿瘤发展。此外,MMPs还可增强肿瘤细胞与宿主细胞间的粘附作用,促进肿瘤新生血管生成等。总之,MMPs在肿瘤的生长、转移及肿瘤组织的血管生成过程中都起到了十分关键的作用。因此MMPs,特别是MMP-2、-9成为近来抗肿瘤侵袭和转移的重要靶点之一。MMPs在正常组织中表达水平较低,其表达与调控主要包括基因表达调控、酶原活化过程的调控和MMPs天然抑制物的调节三个方面。MMPs基因的启动子内含多种转录因子结合位点,如核转录因子NF-κβ、激活蛋白-1(AP-1)位点、信号转导和转录激活因子(STAT)、Ets transcription factors PEA3等,多种因素均可诱导或抑制其转录因子表达及活化,从而启动或抑制MMPs表达。MMPs以酶原形式分泌,只有被激活后才具有降解BM和ECM的活性,人体内存在天然的MMPs特异抑制剂,称之为组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinas,TIMPs),包括 TIMP-1、-2、-3、-4。TIMPs 可通过非共价键形式与MMPs催化区的Zn2+活性中心结合,抑制MMPs的活性。因此,体内MMP/TIMP之间的相互平衡也影响着MMPs活性。多种生长因子可调控MMPs的表达水平,其中TGF-β介导的信号通路对MMPs表达水平的调控发挥这重要作用,越来越引起人们的重视。TGF-β可激活经典的Smad信号通路和非Smad信号传导通路,如促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,包括ERK1/2,JNK和p38,PI3K(磷酸肌醇激酶)/AKT1,2信号通路;NF-κβ信号通路等。其中多项研究证明,TGF-β可通过MAPK及NF-κβ信号通路调控多种MMPs的表达水平,在肿瘤侵袭和转移过程中发挥着重要作用。因此,通过抑制TGF-β介导的信号通路进而抑制MMPs表达水平成为抗肿瘤侵袭和转移的热点之一。目前,MMPs的抑制剂主要包括5类,分别是天然抑制剂(如TIMPs、endostatin 及 angiostatin)、肽类 MMPs 抑制剂(如 Batimastat、Marimastat 和Salimastat)、非肽类 MMPs 抑制剂(AG3340、BAY12-9566、CGS27023A)、四环素类MMPs抑制剂(COL-3、多西环素)、双膦酸盐类MMPs抑制剂。此外,多糖类抗肿瘤药物也表现出抗肿瘤侵袭和转移活性,其中,肝素作为聚阴离子糖胺聚糖,临床上主要应用于抗凝,但近来研究发现,肝素表现出多种抗肿瘤活性,且其抗肿瘤活性与抑制肿瘤侵袭和转移过程中的蛋白水解酶如MMPs、HPA密切相关。为降低肝素的抗凝作用,提高其抗肿瘤活性,人们通过化学修饰手段,制备得到了一系列具有抗肿瘤活性的肝素衍生物。其中,具有代表性的有M402。研究发现,M402可作用于肿瘤发展过程中的多个靶点,表现出明显的抗肿瘤活性。此外,本课题组前期研究发现,通过将肝素直接进行高碘酸钠氧化和硼氢化钠还原后得到的肝素乙二醇断裂衍生物(HP-sp)亦表现出明显的抗肿瘤活性,并初步研究表明其抗肿瘤侵袭和转移活性与抑制HPA的活性相关。但发现其HPA的抑制活性与抗侵袭活性并不一致,考虑到ECM和BM的降解还与MMPs相关,TGF-β介导的MAPK信号通路(包括p38、Erk信号通路)、NF-κ β信号通路对MMPs的表达有重要调控作用,因此,本课题以HP、M402作为对照,通过考察它们对高侵袭和高转移性HepG2细胞及大鼠原发性肝癌模型的作用,进一步研究肝素及衍生物的抗肿瘤侵袭和转移活性,并探讨其抗肿瘤活性与MMPs活性、表达水平及TGF-β介导的信号通路的关系。本研究取得的主要成果有以下几方面:1.肝素衍生物的制备通过对肝素及达肝素进行高碘酸钠氧化和硼氢化钠还原,得到HP-sp和M402,并应用高效分子排阻色谱法对其分子量进行分子量测定,测得HP分子量为 Mn=14037,Mw=17153,Mz=20697,HP-sp 分子量为 Mn=10697,Mw=13254,Mz=17261。该结果结合反应机制表明制备过程中甚少发生糖苷键断裂,主要为开环反应。2.肝素及衍生物的体外抗肿瘤侵袭和转移作用研究2.1利用MTT法测定肝素及其衍生物对肿瘤细胞HepG2增殖的影响采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测了肝素及衍生物对HepG2细胞增殖的影响。研究发现,采用低、中、高浓度的肝素及衍生物分别作用12h、24h、48h,肝素及衍生物对肿瘤细胞的增殖未表现出明显的抑制作用。其中,在高浓度(500μg/mL)给药处理后,HP抑制率为9.96%,HP-sp抑制率为25.9%,M402抑制率为31.2%,均无明显的细胞毒性,提示肝素及衍生物的抗肿瘤活性与抑制细胞增殖活性无关,将来若成药,在肿瘤治疗过程中与其他细胞毒性药物的联合应用或可提高其抗肿瘤作用。2.2利用划痕法测定了肝素及衍生物对HepG2细胞迁移能力的影响采用经典的划痕法测定了肝素及衍生物对HepG2细胞迁移能力的影响。研究发现,HP、HP-sp、M402对HepG2细胞迁移能力均有明显的抑制作用,且随着药物浓度的增高,给药处理时间的增长,其抑制作用也明显增强。其中,给药24h 后,中浓度(200μg/mL)的 HP、HP-sp,高浓度(500μg/mL)的 HP、HP-sp、M402与阴性对照组相比均可抑制HepG2细胞的迁移(P0.05);当给药36h后,中浓度及高浓度的HP、HP-sp、M402与阴性对照组相比均显著抑制HepG2细胞的迁移(P0.05)。2.3利用Transwell小室法测定了肝素及衍生物对HepG2细胞迁移能力的影响采用Transwell小室法测定了肝素及衍生物对HepG2细胞迁移能力的影响。结果表明,给药24h后,与空白对照自相比,低、中、高作用浓度(100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL)的HP、HP-sp、M402组穿过小室的细胞数目均显著减少,且呈现剂量依赖性,并表现出统计意义上的显著性差异(P0.05)。2.4利用Matrigel法测定了肝素及衍生物对HepG2细胞侵袭能力的影响采用Matrigel胶,模拟ECM和BM环境,测定了肝素及衍生物对HepG2细胞侵袭能力的影响。结果表明,MMP抑制剂(MMPI)组、HP组、HP-sp组、M402组穿过Matrigel胶及Transwell小室上层的细胞数目明显减少,且与空白对照组相比,HP-sp组穿过细胞数明显下降(P0.05);HP、HP-sp、M402抑制HepG2穿过小室的能力强于MMPI组(P0.05)。2.5利用Wester Blot法测定了肝素及衍生物对TGF-β介导的信号通路中相关蛋白表达的作用通过Western Blot法测定了不同作用浓度(0、1、5、10、20μg/ml)的TGF-β对HepG2细胞中MMP-2、-9表达的影响。结果表明,TGF-β对HepG2细胞的MMP-2、-9分泌水平均有提高作用,且呈现剂量依赖性;其中,当作用浓度为10μg/ml时,TGF-β对MMP-2、-9表达水平均显著提高。通过Western Blot法测定了HP、HP-5P、M402对TGF-β诱导的MMP-2、-9高表达的影响。用1Oμg/ml的TGF-β刺激后给予MMPI、HP、HP-sp、M402,结果表明,与TGF-β刺激组相比,HP、HP-sp、M402均可抑制MMP-2、-9表达水平。其中,MMPI、HP、HP-sp、M402组MMP-2的的相对含量分别降低为89.8%、65.5%、66.9%、61.8%,与 TGF-β刺激组相比,MMPI 组 MMP-2 蛋白含量略有下降,但未表现出显著差异(P0.05),HP、HP-sp、M402组MMP-2蛋白含量均显著下降(P0.05);MMP-9的相对含量分别降低为94.6%、61.9%、69.0%、69.5%,与TGF-β刺激组相比,MMPI组MMP-9含量略有下降,但未表现出显著差异(P0.05),HP-sp、M402组MMP-9蛋白含量均明显(P0.05)。通过Western Blot法测定了HP、HP-sp、M402对TGF-β介导的信号通路蛋白NF-κβ、p38、Erk表达的影响。结果表明,HP、HP-sp、M402均可抑制信号通路蛋白的表达,但MMPI的作用不明显。与TGF-β刺激组相比,MMPI、HP、HP-sp、M402 组 NF-κβ 的相对含量分别降低为 87.6%、69.4%、59.8%、54.2%。与TGF-β刺激组相比,HP-sp组NF-κβ蛋白表达水平明显下降(P0.05);p38的相对含量分别降低为82.3%、49.2%、67.5%、55.8%,与TGF-β刺激组相比,HP、HP-sp、M402组p38蛋白表达水平均明显下降(P0.05);Erk的相对含量分别降低为92.8%、77.7%、59.6%、55.9%,虽也表现出抑制作用,但与TGF-β刺激组相比均未表现出显著性差异。3.肝素及衍生物的体内抗肿瘤侵袭和转移作用研究通过建立高转移及高侵袭性的大鼠肝癌模型,考察了 HP、HP-sp、M402在体内的抗肿瘤侵袭和转移活性及作用机制。与造模组相比,HP、HP-sp、M402在20mg/kg剂量下均能降低肝重/体重比值(肝重/体重比值是原发性肿瘤质量指数的指标之一,比值越大,肿瘤组织的数量及体积越大。),减少小鼠肝部结节数,减轻由原发性肝癌转移引起的肺部病变情况。大鼠肝脏HE染色结果表明,与造模组相比,HP、HP-sp、M402能有效抑制肝脏细胞坏死,减少肝窦淤血现象,减少细胞及纤维组织增生,改善肝脏病变状况。大鼠肝脏免疫组化染色结果表明,造模组MMP-2、-9,特别是MMP-9表达水平明显升高,且大量集中在血管周围;与造模组相比,HP组、HP-sp组及M402组MMP-2、-9表达量明显降低,证明肝素及衍生物均可抑制肿瘤的侵袭转移过程,且与其降低MMP-2、-9表达水平密切相关。4.课题总结与创新本课题从细胞水平及动物水平上研究了 HP、HP-sp、M402的抗肿瘤侵袭和转移活性及与MMPs表达水平的关系。结果表明,(1)HP、HP-sp、M402无明显的细胞增殖抑制作用;(2)HP、HP-sp、M402能显著抑制HepG2细胞迁移能力,且呈现时间和剂量依赖性;(3)HP、HP-sp、M402能显著抑制HepG2细胞的侵袭,比MMPI抑制作用更强;(4)HP、HP-sp、M402均可明显降低HepG2细胞的MMP-2、-9的表达水平;(5)HP、HP-sp、M402可显著降低TGF-β/MAPK/p38/MMPs信号通路中p38蛋白表达水平;HP-sp可显著降低TGF-β/NF-κβ/MMPs信号中NF-κβ蛋白表达水平。(6)HP、HP-sp、M402均可减少原发性肝癌大鼠模型中肝部肿瘤结节数和肺转移;HP、HP-sp、M402均可显著降低原发性肝癌大鼠肝部MMP-2,MMP-9表达水平。总之,在本实验研究中,以HP和M402为对照,选取高侵袭和高转移性细胞株HepG2细胞和高侵袭高转移的原发性肝癌大鼠模型,研究了非抗凝活性的肝素衍生物HP-sp抗肿瘤活性与MMPs活性和表达水平关系及作用机制,结果表明HP-sp无细胞毒作用,可以通过抑制MMP-2和MMP-9的表达发挥体内外抗肿瘤侵袭和转移作用,该作用与抑制TGF-β介导的P38/NF-κβ信号通路有关。该研究丰富了 HP-sp抗肿瘤转移的机制,即它是HPA和MMPs的双重抑制剂,值得进一步研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

【参考文献】