阿法替尼逆转ABCB1转运体介导的卵巢癌化疗多药耐药性及其作用机制研究

发布时间：2018-11-29 09:47

【摘要】：背景和目的多药耐药性(Multidrug resistance, MDR)是指对一种药物产生耐药性的同时,对其它结构不同,作用靶点不同的药物也产生耐药性的现象。ABCB1转运体(ATP结合盒式转运体B亚家族成员1)的高表达是MDR产生的根本原因之一。紫杉醇(ABCB1转运体底物)联合铂类药物是晚期卵巢癌患者的一线化疗方案。但卵巢癌患者多因MDR的产生,导致化疗失败。大量研究报道卵巢癌患者中ABCB1转运体的异常高表达与患者化疗疗效及预后呈负相关。因此,逆转ABCB1转运体介导的卵巢癌化疗的MDR具有重要的临床意义和紧迫性。以ABCB1为靶点,合成或寻找其抑制剂,通过抑制ABCB1转运体的外排功能或(和)其在肿瘤细胞的高表达,可逆转ABCB1介导的MDR。近年来,大量ABCB1抑制剂被发现,个别甚至已进入临床试验阶段。但这些ABCB1抑制剂因毒副作用过大或体内药代动力学过程不明确等原因而研发失败。因此,从无以上局限性的已上市药物中,寻找一种可显著抑制ABCB1转运体的药物,作为ABCB1转运体介导的MDR逆转剂进行开发,可能是一种更好的解决策略。近年来,抗肿瘤药物的开发已从传统的细胞毒性化疗药物过渡到分子靶向药物。目前,酪氨酸激酶是仅次于G蛋白偶联受体的第二大药物靶点。已有研究报道多种小分子靶向的酪氨酸激酶抑制剂类药物(Tyrosine Kinase Inhibitors, TKIs)可通过抑制ABCB1转运体的外排功能,进而增敏化疗药物的疗效,但其作用机制尚不明确。此外,鲜见有关TKIs类药物与ABCB1之间相互作用模式的研究报道。阿法替尼(Afatinib)是首个不可逆的多靶点的TKI。与靶蛋白的不可逆性结合可导致下游信号通路持续受到抑制,产生更强的作用效果。因此,阿法替尼在与ABCB1转运体相互作用时,相较于可逆性的TKIs类药物可能具有不同的特性。然而,目前关于阿法替尼逆转ABCB1转运体介导的MDR的研究尚未见报道。综上,本课题拟通过研究阿法替尼对ABCB1转运体介导的卵巢癌化疗MDR的影响及其作用机制,探究阿法替尼作为MDR逆转剂的潜力,进一步揭示TKIs类药物调控ABCB1转运体的机制,比较非可逆性TKIs类药物相较于可逆性TKIs类药物在逆转ABCB1转运体介导的MDR作用方面的差异及优势。方法采用MTT法考察阿法替尼对卵巢癌细胞的细胞毒性及其逆转耐药卵巢癌细胞MDR的作用；通过siRNA干扰技术敲低卵巢癌细胞内ABCB1转运体的表达水平,验证阿法替尼逆转MDR的作用与.ABCB1转运体的相关性；应用AnnexinV-FITC/PI染色结合流式细胞术及TUNEL实验,分别在体外及体内水平考察阿法替尼对紫杉醇诱导的耐药卵巢癌细胞凋亡的影响：通过裸鼠移植瘤实验考察阿法替尼体内水平逆转卵巢癌MDR的作用；采用罗丹明123蓄积实验、药物体外转运实验、小动物活体成像实验及ATPase活性实验考察阿法替尼对ABCB1转运体功能的影响及其机制;通过western blot、RT-PCR、免疫组化、组织免疫荧光、细胞免疫荧光等实验评价阿法替尼对ABCB1转运体表达的影响并探究其机制；利用药效团模型考察阿法替尼抑制ABCB1转运体的结构基础;通过同源建模及分子对接实验探究阿法替尼与ABCB1转运体相互作用的结合模式；应用基因测序技术考察阿法替尼逆转ABCB1转运体介导的MDR的作用是否涉及特定基因位点的突变。结果1.阿法替尼体外水平逆转ABCB1介导的卵巢癌化疗MDR紫杉醇对敏感株A2780及耐药株A2780T细胞的半数抑制浓度值(IC50)分别为0.039±0.003μM及198.92±14.85μM；阿霉素对敏感株A2780及耐药株A2780T细胞的IC50分别为1.17±0.06μM及27.69±2.11μM;紫杉醇对敏感株SKOV3及耐药株SKOV3-DDP细胞的IC50分别为0.033±0.002μM及41.79± 3.67μM；阿霉素对敏感株SKOV3及耐药株SKOV3-DDP细胞的IC50分别为0.97±0.07μtM及18.13±1.54μM。以上敏感株与耐药株对化疗药物的敏感性差异均具有统计学意义(P0.01),表明本实验中所采用的两种耐药株细胞相较于两种敏感株细胞,对ABCB1转运体底物性化疗药物紫杉醇及阿霉素具有高度的耐药性。卵巢癌耐药株A2780T细胞内ABCB1转运体的蛋白表达水平及MDR1基因mRNA水平分别是敏感株A2780细胞内的83.3倍及142.9倍；卵巢癌耐药株SKOV3-DDP细胞内ABCB1转运体的蛋白表达水平及MDR1基因mRNA水平分别是敏感株SKOV3细胞内的37.0倍及23.3倍。阿法替尼可浓度依赖性的显著降低紫杉醇及阿霉素对ABCB1高表达的耐药卵巢癌细胞A2780T及SKOV3-DDP的IC50。联用0.625μM、1.25μM及2.5μM的阿法替尼时,紫杉醇对A2780T细胞的IC50分别为115.53±6.65μM、19.74±1.19μM及8.86±0.721μM,较未联用阿法替尼组紫杉醇的IC50分别显著下降了1.72倍、10.08倍及22.45倍(P0.01)；联用0.375μM、0.75μM及1.5μM的阿法替尼时,紫杉醇对SKOV3-DDP细胞的IC50分别为23.53±2.47μM、9.82± 0.80μM及5.75±0.471μM,较未联用阿法替尼组紫杉醇的IC50分别显著下降了1.78倍、4.26倍及7.27倍(P0.01)；联用0.625μM、1.25μM及2.5μM的阿法替尼时,阿霉素对A2780T细胞的IC50分别为6.24±0-37μM、3.93±0.22μM及1.57±0.13μM,较未联用阿法替尼组阿霉素的IC50分别显著下降了4.44倍、7.05倍及17.64倍(P0.01)；联用0.375μM、0.75μM及1.5μM的阿法替尼时,阿霉素对SKOV3-DDP细胞的IC50分别为9.17±1.05μM、3.58±0.29μM及1.25±0.13μM,较未联用阿法替尼组阿霉素的IC50分别显著下降了1.98倍、5.06倍及14.50倍(P0.01)。然而,阿法替尼不改变紫杉醇及阿霉素对ABCB1低表达的卵巢癌敏感株A2780及SKOV3细胞的IC50。此外,阿法替尼逆转耐药卵巢癌细胞对紫杉醇及阿霉素MDR的效果,强于相同浓度的可逆性的TKIs类药物拉帕替尼及经典的ABCB1转运体抑制剂维拉帕米(10μM)。敲低A2780T及SKOV3-DDP细胞内ABCB1转运体的表达水平,可显著降低紫杉醇及阿霉素对A2780T及SKOV3-DDP细胞的IC50(P0.01)。联用阿法替尼可进一步显著降低紫杉醇及阿霉素对A2780T/ABCB1-及SKOV3-DDP/ABCB1-的IC50(P0.01)。2.阿法替尼体内水平逆转ABCB1介导的MDR对照组、紫杉醇组、阿法替尼组及阿法替尼与紫杉醇联用组肿瘤平均重量分别为0.707±0.229 g、0.655±0.289 g、0.247±0.088 g及0.113±0.079 g。阿法替尼与紫杉醇联用不仅显著延缓了荷瘤裸鼠背部A2780T细胞异种移植瘤的生长,抑制率为84.02%,而且显著诱导了肿瘤坏死及肿瘤退行性生长。3.阿法替尼体内外水平均可显著增强紫杉醇诱导的耐药卵巢癌细胞的凋亡作用阿法替尼体外水平可浓度依赖性的显著增加紫杉醇诱导的卵巢癌A2780T及SKOV3-DDP细胞的凋亡率(P0.01)。此外,体内TUNEL实验结果显示,阿法替尼与紫杉醇联用组裸鼠肿瘤组织镜下可见大量阳性染色的细胞核,且核破裂及核溶解的细胞比例增加,表明该组肿瘤组织发生了显著的细胞坏死。4.阿法替尼抑制ABCB1转运体的外排功能,激活其ATPase活性联用阿法替尼(0.625～10μM)可浓度依赖性的显著增加罗丹明123在A2780T细胞内的蓄积(P0.05),而对其在A2780细胞内的蓄积没有显著影响(P0.05)。有意义的是,阿法替尼与罗丹明123联用组荷瘤裸鼠肿瘤区域的荧光强度值较罗丹明123组显著增加了2.28倍(P0.01)。阿法替尼(0.625～10μM)可浓度依赖性的显著减少罗丹明123自A2780T细胞中的外排量(P0.05),而对其自A2780细胞内的外排量没有显著影响(P0.05)。上述结果表明阿法替尼可通过抑制ABCB1转运体的外排功能,进而增加罗丹明123在A2780T细胞内的蓄积。此外,阿法替尼及紫杉醇均可激活ABCB1转运体的ATPase活性。激活50%的ABCB1转运体的ATPase活性所需的紫杉醇及阿法替尼的浓度分别为70.1μM及2.5μM。5.阿法替尼通过抑制NF-κB通路的激活进而下调ABCB1转运体的表达阿法替尼可浓度依赖性的显著抑制ABCB1高表达的卵巢癌A2780T及SKOV3-DDP细胞内ABCB1转运体的蛋白表达水平及MDR1基因的mRNA水平,而可逆性的TKIs类药物拉帕替尼不具有此作用。阿法替尼也可下调接种A2780T细胞获得的荷瘤裸鼠肿瘤组织内ABCB1转运体的蛋白表达水平。此外,NF-κB抑制剂PDTC及NF-κB亚基p65特异性的siRNA均能下调A2780T细胞内ABCB1转运体的表达水平。此外,阿法替尼可显著降低A2780T细胞胞浆及胞核内NF-κB亚基p65的表达水平,同时也可显著抑制IκBα的磷酸化及降解。与NF-κB的抑制剂PDTC作用相似,阿法替尼可下调A2780T细胞内基础的核p65水平及抑制LPS诱导的p65的核转位。上述结果表明阿法替尼可通过抑制NF-κB通路的激活,进而下调耐药卵巢癌细胞内ABCB1转运体的表达。阿法替尼可显著抑制A2780T细胞内AKT的磷酸化,而对AKT总蛋白表达水平没有显著影响。此外,PI3K/AKT通路特异性抑制剂LY294002也可显著抑制A2780T细胞内p65的核转位。阿法替尼与LY294002在抑制A2780T细胞内ABCB1转运体的表达方面具有协同作用。阿法替尼可能通过下调PI3K/AKT通路,进而抑制NF-κB通路的激活,起到下调BCB1转运体表达的作用。6.阿法替尼逆转ABCB1转运体介导的卵巢癌MDR的作用与抑制MAPK/p38通路相关已有研究报道通过抑制EGFR下游的MAPK通路可部分逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。阿法替尼可浓度依赖性的抑制A2780T细胞内EGFR、HER-2及p38的磷酸化,而对EGFR、HER-2及p38的总蛋白表达水平没有显著影响。此外,阿法替尼对A2780T细胞内JNK及ERK1/2的总蛋白及磷酸化蛋白表达水平均没有显著影响。p38及AKT是NF-κB通路的上游调节蛋白,该结果表明阿法替尼可通过抑制EGFR及HER-2的磷酸化,进而下调其下游的MAPK/p38及PI3K/AKT通路,抑制NF-κB通路的激活,起到下调ABCB1转运体表达的作用。7.本研究中阿法瞀尼逆转ABCB1转运体介导的卵巢癌MDR的作用不涉及EGFR酪氨酸激酶区域的突变超过90%的EGFR突变发生在EGFR受体的酪氨酸激酶区域,该区域由EGFR基因的18-21号外显子编码。测序结果显示,卵巢癌敏感株(A2780及SKOV3)及耐药株(A2780T及SKOV3-DDP)细胞内EGFR基因的18-21号外显子均为野生型,未发生突变,表明本研究中阿法替尼逆转ABCB1转运体介导的卵巢癌MDR的作用不涉及EGFR酪氨酸激酶区域的突变。8.阿法替尼作为ABCB1转运体抑制剂的结构基础选择性的ABCB1转运体抑制剂应具有5个药效团特征,包括1个芳香环、1个疏水中心和3个氢键受体。阿法替尼与ABCB1转运体抑制剂的药效团模型匹配性极佳。阿法替尼分子结构中的苯环与药效团模型中的芳香环相对应；阿法替尼分子结构中的氟原子及其相连的苯环构成了疏水中心,与药效团模型中的疏水中心相对应；阿法替尼分子结构中的3个氧原子与药效团模型中的3个氢键受体相对应。因此,阿法替尼具有ABCB1转运体抑制剂的药效团特征。9.阿法替尼与ABCB1阜运体之间的结合模式分子对接实验结果表明阿法替尼与人ABCB1转运体有2个结合域,包括1个底物结合域和1个ATP结合域。阿法替尼与ABCB1转运体的ATP结合域及底物结合域的结合能分别是-14.05 kcal/mol及-14.09 kcal/mol。阿法替尼与ABCB1转运体的ATP结合域的相互作用包括3个氢键和一个H-π作用。其中,阿法替尼分子结构中的四氢呋喃环上的氧原子与ABCB1转运体的Gly533及Gly534两个位点形成2个氢键;分子结构中的的叔胺基与ABCB1转运体的Lys536位点形成1个氢键；分子结构中的含N杂环与ABCB1转运体中的Ala560位点形成1个H-π作用。测序结果发现,人正常L02细胞、未处理的卵巢癌敏感株、耐药株细胞及阿法替尼给药后的卵巢癌敏感株、耐药株细胞在这4个位点均未发生突变,表明本研究中阿法替尼逆转ABCB1转运体介导的卵巢癌MDR的作用不涉及该4个结合位点的突变。结论阿法替尼体内外水平均可显著逆转ABCB1转运体介导的卵巢癌化疗的MDR。与可逆性的TKIs类药物不同,首个不可逆性的TKIs类药物阿法替尼逆转ABCB1转运体介导的MDR的作用具有双模式：即阿法替尼不仅可抑制ABCB1转运体的外排功能并激活其ATPase活性,还可通过下调MAPK/p38及PI3K/AKT通路,进而抑制NF-κB通路的激活及MDR1基因的转录活性,下调ABCB1转运体的表达。此外,除作用于ABCB1转运体的底物结合域外,阿法替尼还可能与ABCB1转运体的Gly533, Gly534, Lys536及Ala560四个位点形成氢键,进而作用于ABCB1转运体的ATP结合域。且本研究中阿法替尼逆转ABCB1转运体介导的卵巢癌MDR的作用不涉及上述4个结合位点的突变及EGFR酪氨酸激酶区域的突变。本研究提示可将阿法替尼与ABCB1转运体底物性化疗药物(紫杉醇、阿霉素等)联用,以取得更佳的化疗效果并逆转MDR。本研究有助于从分子靶向药物中寻找高效的ABCB1抑制剂,以更加安全有效的逆转ABCB1转运体介导的MDR。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96

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