Telekin抗肿瘤多药耐药作用及机制研究

发布时间：2018-12-13 07:53

【摘要】：全球癌症发病率居高不下,癌症作为一种恶性疾病严重威胁着人类健康。作为如今肿瘤的主要治疗方法之一的化疗法,其治疗效果受到肿瘤细胞的多药耐药作用的限制。因此,开发抗癌活性高,并且能够抗癌细胞多药耐药的抗肿瘤药物成为了抗肿瘤药物的研究热点。本课题针对Telekin的抗肿瘤多药耐药作用及其机制展开相关研究工作,所用到的研究对象-化合物Telekin是从天然植物金挖耳中提取的一种桉烷内酯类化合物,在前期实验中已经发现其具有良好的抗肿瘤活性。基于前期Telekin抗肿瘤机制的研究结果,本论文发现其对多药耐药的癌细胞也有抑制作用并进一步展开机制探讨工作。我们选取了三组耐药及其亲本细胞株K562、K562/A02,KB、KB/VCR,MCF-7、MCF-7/ADR进行药物敏感性筛选。MTT结果显示,Telekin对于多药耐药细胞具有直接的较强毒性,与传统化疗药物长春新碱,阿霉素等相比具有不受耐药泵影响的优势,且对K562/A02及K562细胞的药物敏感性高于其他两对组织来源的细胞株,对K562/A02及K562的细胞增殖抑制作用呈现出时间及浓度的依赖性。采用Annexin V/PI双染法以及DAPI染色对经Telekin处理48h后的K562/A02及K562细胞进行调亡检测。结果显示,Telekin对K562/A02及K562具有都诱导细胞调亡的作用,Western Blot对凋亡相关蛋白Bc1-2家族以及Caspase家族蛋白的表达量进行检测后,我们发现在Telekin的作用下,K562/A02细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量降低,凋亡促进蛋白Bax表达量升高;未活化的Caspase-9和Caspase-3蛋白的表达量降低,同时其活化形式的Cleaved Caspase-9和Cleaved Caspase-3的表达量明显增加,并呈现出浓度依赖性。以上结果表明,Telekin可能通过调节Bcl-2家族及Caspase家族蛋白表达,诱导K562/A02细胞凋亡。在后续实验中,我们主要对Telekin抗多药耐药的作用机制进行相关研究。由于P-gp泵对药物的外排被认为是引起肿瘤细胞多药耐药作用的主要因素之一。我们首先采用Rhl23及阿霉素在细胞内的累积实验对Telekin处理的K562/A02细胞中的P-gp进行探究。流式细胞仪分析结果说明,经非毒性剂量Telekin处理的K562/A02细胞内的Rhl23及阿霉素积累量无明显增加,Telekin(10 μmol/L,20μmol/L)处理的K562/A02细胞内Rhl23及阿霉素累积量有明显增加。由此,我们推测,Telekin可能不是通过增加化疗药物的细胞内含量,而是直接诱导耐药细胞凋亡,由于在毒性剂量下Telekin抑制耐药细胞中P-gp蛋白的表达,从而引起P-gp泵功能的下调。进而,我们对Telekin抑制P-gp转录和蛋白表达做进一步的探讨。我们用流式细胞仪,Western Blot及实时定量PCR对P-gp蛋白表达量进行检测,实验结果表明经不同浓度Telekin处理的K562/A02细胞中P-gp的蛋白表达及转录水平均明显降低,且呈现出浓度依赖性。我们也针对Telekin对另外两种与多药耐药相关的蛋白MRP-1以及ABCG2的影响进行了探究。由于ABCG2在乳腺癌耐药细胞株中呈现高表达,故我们选用人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/A及其亲本细胞株MCF-7,针对Telekin对细胞中ABCG2的作用进行研究。流式细胞仪和实时定量PCR结果显示,Telekin能够抑制K562/A02细胞中MRP-1蛋白的表达量以及其转录水平的表达,并呈现浓度依赖性。米托蒽醌累积实验结果表明,经高浓度(20 μmol/L)Telekin处理的MCF-7/A细胞内米托蒽醌的累积量显著增加,并呈现出浓度依赖性。我们进一步对ABCG2蛋白的表达进行检测。Western Blot以及RT-PCR实验结果表明,经不同浓度Telekin处理的MCF-7/A细胞中ABCG2的蛋白表达及转录水平均明显降低,且呈现出浓度依赖性。综合实验结果,我们推测,Telekin也抑制耐药细胞中MRP-1及ABCG2蛋白水平及转录水平的表达。由于P-gp的编码基因MDR1启动子核心区域存在能够与NF-κB相结合的特异性区域,ABCG2的启动子能够与NF-κB的p50亚基结合。NF-κB通路的活化能够上调P-gp及ABCG2蛋白的表达,最终引起肿瘤细胞多药耐药作用,故我们主要针对AKT/NF-κB信号通路对P-gp及ABCG2蛋白表达的调控进行了进一步探究。Western Blot检测结果表明,在Telekin处理的K562/A02及MCF-7/A细胞中phospho-AKT与NF-κB表达量明显降低,I-κB的表达量升高。Telekin能够通过调节AKT/NF-κB信号通路,并且对其细胞中高表达的多药耐药作用相关蛋白P-gp、ABCG2的表达具有抑制作用。综上所述,Telekin能够绕过多药耐药细胞中P-gp耐药泵的作用,并下调多种多药耐药泵的转录和蛋白表达直接诱导多药耐药细胞凋亡,是一个具有发展潜力的抗肿瘤多药耐药的天然产物,我们的研究也为其今后的进一步开发与临床应用提供了有价值的实验数据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

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本文编号：2376189