六株不同海洋生境来源真菌次级代谢产物化学结构和生物活性研究

发布时间：2019-01-04 17:43

【摘要】：海洋作为一个区别于陆地的独立生态系统,其独特的生态环境造就了海洋来源微生物次级代谢产物新颖的化学结构和丰富的生物活性。而作为海洋微生物一个重要组成部分的真菌资源,因其巨大的生物活性物质代谢潜能,俨然成为了天然药物化学家寻找活性新药先导化合物的重要来源。本论文从真菌次级代谢产物多样性和菌株代谢潜能挖掘两个方面,以六株不同海洋生境来源的真菌作为研究菌株,对真菌发酵次级代谢产物的化学结构和生物活性进行了系统全面的研究。本文主要的研究内容包括：抗肿瘤活性菌株的分离与筛选；目标菌株次级代谢产物的分离与纯化；化合物结构的鉴定；新颖化合物多种生物活性的评价；研究菌株代谢潜能的挖掘。从来自广东和广西红树林来源的16个泥样样品中共分离纯化得到真菌300株,通过真菌形态排重,结合TLC薄层层析、HPLC指纹图谱化学筛选和小鼠P388细胞毒活性筛选模型的方法,共得到具有显著抗肿瘤活性且代谢产物丰富的潜力菌株26株。从分离的菌株和实验室菌株库中选取了两株广东红树林泥样来源产黄青霉Penicillium chrysogenum HDN11-24、黄曲霉Aspergillus flavus HDN11-47,两株广西红树林泥样来源真菌Aspergillus sp. HDN11-84, Sarocladium kiliense HDN11-112,一株胶州湾海泥来源真菌Aspergillus westerdijkiae HDN13-512、一株深海泥样来源青霉Penicillium sp. F23-2,共计六株活性目标菌株作为本论文的研究对象。对六株活性目标菌株实验室发酵所得的粗提物,采用实验室常用的硅胶柱色谱层析、薄层色谱层析、反相ODS柱色谱层析、Sephadex LH-20凝胶柱色谱层析和HPLC柱色谱层析等化学分离纯化手段,从青霉Penicillium sp. F23-2的PYG培养基的摇床发酵的提取物中分离得到14个化合物(1-14),大米静置条件下大发酵粗浸膏中分离得到12个化合物(14-26),其突变菌株中分离4个化合物(27-30)；从菌株HDN11-84的真菌3号培养基发酵的提取物中分离得到16个化合物(31-46)；从菌株HDN11-112的真菌3号培养基发酵的提取物中分离得到5个化合物(47-51)；从菌株HDN13-512的真菌3号培养基发酵的提取物中分离得到9个化合物(52-60)；从产黄青霉HND11-24的真菌2号液体培养的提取物中分离得到16个化合物(61-76)；从黄曲霉HDN11-47的真菌2号摇床培养的代谢产物中分离得到13个化合物(77-89),总共从六株目标真菌中分离纯化89个化合物。同时对所有分离得到的单体化合物采用质谱、核磁共振谱、红外光谱和紫外光谱、化合物的理化性质以及圆二色谱、X-ray单晶衍射和化学反应方法验证全部88个化合物化学结构。所有化合物的结构类型包括：生物碱类化合物36个(9-10,20-24,27-29,31-46,47-48,52-53,70,73-75,89),聚酮类化合物41个(1-8,11-19,25,30,49-51,54-69,71-72,76),甾萜类化合物8个(77-84),其它类化合物4个(85-88),其中新化合物42个,新天然产物2个。包括5个罕见的含氮sorbicilline类单体、二聚、三聚的生物碱化合物(1-5),1个sorbicilline类二聚体(25),5个新颖的环己烯酮类化合物(15-19),2个NRPS-PKS杂合的大环内脂类化合物(47-48),3个新颖的桔霉素类化合物(61-62,64),1个新的xanthone类化合物(63),5个新的五元内脂类化合物(54-58),9个新的Epidithiodioxopiperazines类化合物(31-46),1个甾体类化合物(77)以及5个新的其他类生物碱(24,28-29,52-53)。采用NOEEY、圆二色谱及生物合成途径的推导,确定了化合物(1-5,61,64)的绝对构型；通过X-Ray单晶衍射、NOE、化学反应方法和CD确定了化合物(15-19)的绝对构型；利用X-Ray单晶衍射、NOESY和Marfy反应法,确定化合物(47-48)的绝对构型；采用X-Ray单晶衍射方法确定甾体化合物(77)的绝对构型；与报道文献的旋光数据对比确定化合物(63)的绝对构型。为了寻找可能潜力的药物先导化合物,研究分离得到的天然产物的生物学活性,实验对部分单体化合物的抗肿瘤、抗菌等生物活性进行初步的评价与筛选。以药理实验室常有的A54、BEL-7402, HEK-293等五种肿瘤细胞株为模型,采用SRB法和MTT法评价天然产物的细胞毒活性；以纸片法评价部分单体化合物对金黄色葡萄球菌、结核杆菌等致病菌的生物活性。评价结果表明化合物1对HCT116肿瘤株有抑制活性(IC50=10/μm),但与此同时评价的同类型化合物2-5没有表现出明显的抗肿瘤活性(IC5010/μm);化合物47-48表现对A549肿瘤细胞株具有较好的的细胞毒活性(IC50值分别为4.5μM和6.0μM)；化合物61和64对Hela, BEL-7402, HEK-293, HCT-116, A549肿瘤细胞株表现出较好的细胞毒活性(IC50 3.2～10.5 μM);化合物77对HL-60细胞株有较好的细胞毒活性(ICso 6.4 μm);化合物34对HL-60和A549有较好的生长抑制活性(在初始浓度在50μM时的抑制率为78.2%和80.4%)：化合物15-19在抗菌活性的筛选中表现出对金黄色葡萄球菌的良好抑制活性。综上,本论文对在6株不同海洋生境来源真菌实验室条件下大发酵所得的次级代谢产物进行分离,共得到的89个天然产物,其中包括35个新化合物和2个新天然产物。在对新化合物结构的研究中,首次利用ECD计算的方法确定了含氮sorbiclline类生物碱的立体构型,并发现其具有较好的细胞毒活性；发现了一系列具有抗金黄色葡萄球菌活性的环己烯酮类化合物：同时发现并筛选到PKS-NRPS杂合的大环内脂类化合物的抗肿瘤活性；对研究菌株采用OSMAC策略和诱导突变的方式挖掘菌株的代谢潜能,增加了菌株次级代谢产物化学结构的多样性和发现生物活性良好先导化合物的几率。上述实验研究为海洋天然产物化学研究中菌株代谢潜能的挖掘,化合物结构的确定提供了新的研究方向。
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【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R915

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