穿膜肽介导的眼内基因递送系统

发布时间：2019-01-16 09:42

【摘要】：眼内新生血管性疾病是一类眼部的高发病变,可引起包括老年黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿等致盲性眼部疾病。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在眼内新生血管性疾病的发生、发展中起着重要作用,成为主要的治疗靶点之一。目前临床上采用整合素、单克隆抗体、适配体及干扰RNA等药物拮抗VEGF,起到抑制新生血管形成的作用。这类治疗用生物大分子由于分子量大、亲水性强,通过滴眼的方式给药很难吸收到达眼后段,必须采用玻璃体内注射给药,导致患者顺应性差。因此,如何改善此类药物通过非损伤途径给药的眼部吸收是药剂学工作者关注的焦点。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides, CPPs)是一类具有穿透细胞膜能力的短肽,一般由不超过30个氨基酸残基构成,分子整体带正电荷。CPP以非受体依赖方式穿过细胞膜,转导效率高且不易造成细胞损伤。目前常用的CPPs有TAT(转录蛋白反式作用子)、聚精氨酸、穿膜素(penetratin 或 transportan)等,利用这些CPPs已成功地将蛋白质、核酸、纳米粒、脂质体等多种生物大分子或纳米制剂递送到细胞中。本文旨在从目前研究较成熟的穿膜肽中筛选出一种眼部透过性及安全性良好的穿膜肽。并构建一种CPPs介导的非损伤性眼部基因递送系统,改善基因药物经由结膜囊内给药在眼后段的吸收,取代目前常用的玻璃体内注射的给药方法,提高患者顺应性,为实现生物活性大分子药物的眼部递送提供新途径。本文第一部分针对Penetratin, Protamine、TAT、Poly(arginine)8四种备选穿膜肽及电中性的Poly(serine)8对照肽展开了体内外评价。采用结膜细胞摄取实验、细胞毒性实验、家兔离体角膜透过性实验和大鼠在体结膜囊内给药观测眼内分布等一系列评价方法,系统地对CPPs的眼部透过性进行研究。我们发现,在四种备选穿膜肽中,Penetratin具有最强的眼部透过性及安全性,细胞摄取量是对照肽Poly(serine)8的16～29倍,离体角膜表观透过系数达到对照肽的87.5倍；结膜囊内给药能够快速吸收,且在眼后段广泛分布。采用圆二色谱对四种穿膜肽的构象进行比较发现,Penetratin的眼部透过性与其两亲性及独特的脯氨酸二型螺旋构型有关。此外,选取了与备选穿膜肽氨基酸序列相同的D构型穿膜肽进行比较研究,结果发现构型发生转换后穿膜肽的眼部透过性减弱,因而确定了L构型的Penetratin作为下一步研究中采用的优选穿膜肽分子。本文第二部分采用红色荧光蛋白质粒(pRFP)、低分子量分枝状阳离子聚合物(Low molecular weight Branched Cationic Polymer,LBCP)与穿膜肽Penetratin(P)设计并制备了两种不同结构的物理复合物pRFP/P与pRFP/LBCP/P,采用静电结合方式压缩报告基因,并对其进行了处方筛选、结构确证和理化性状表征。优化得到两种物理复合物的基本处方：复合物pRFP/P处方中Penetratin与pRFP的电荷比为20：1；复合物pRFP/LBCP/P中LBCP与pRFP的氮磷比为5：1,Penetratin与pRFP的电荷比为20：1。采用超滤离心法对复合物的形成进行了验证。两种复合物pRFP/P与pRFP/LBCP/P的粒径分别在400nm和100～200 nm左右,其中PAMAM参与形成的处方粒径小于其他各组,显示出更强的基因压缩效果和结合穿膜肽的能力。透射电镜实验结果证实各组物理复合物的外观圆整均一,颗粒大小与粒径测定结果相符。本文第三部分针对前文制备优化得到的复合物处方进行了体内外多水平的系统评价,采用人结膜细胞与角膜细胞作为体外模型对各组复合物进行了体外转染效率的定性定量考察、细胞摄取机理探究等相关研究。筛选得到了用于眼部基因递送的最优处方：pRFP/P20及pRFP/PAMAM/P20+PAMAM5。大鼠在体结膜囊内给药实验证实,二者在眼内均可达到较好的转染效果。眼部药动学实验结果表明两种复合物经滴眼给药可以快速吸收入眼,并且在眼后段滞留时间长达8h以上。综上,本课题通过体内外筛选得到一种眼部透过性与安全性俱佳的穿膜肽Penetratin,成功构建了两种由质粒DNA、低分子量分枝状阳离子聚合物与穿膜肽自组装的基因递送系统。该给药系统促进基因通过非损伤途径快速吸收,并在眼后段分布和表达,为眼内新生血管性疾病的基因药物治疗提供了新思路。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R943

【共引文献】