【摘要】：芥子气(Sulfur mustard,SM)是一种糜烂性化学战剂,曾在第一次、第二次世界大战及两伊战争中广泛使用,由于其使用最多、最为普遍和伤害较大,被称为“毒剂之王”。二战后,日本遗留在中国的化学战剂以SM为主,时有造成我平民伤害的报道。SM结构简单,容易合成,易被恐怖分子掌握和利用。美国疾病控制与预防中心2000年4月发表的关于“生化恐怖战备计划”的建议中指出,恐怖分子可能使用的毒剂包括化学战剂和一般的工业毒性化合物,但最有可能使用的仍然是神经性毒剂、糜烂性毒剂和氰类毒剂。皮肤、眼及呼吸系统是SM局部中毒的主要靶器官,而骨髓、造血、免疫系统等是SM全身中毒的主要靶器官。SM损伤的作用机理复杂,至今尚未完全阐明,且无理想的防治药物。因此,研制作用更强、疗效更好的新型SM防治药物是亟待解决的主要问题之一。SM是一种双功能烷化剂,主要与细胞中的DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物和脂肪等生物大分子发生反应。严重的DNA损伤是SM导致细胞死亡的主要原因。SM导致DNA损伤后,许多生化途径被激活用于保护细胞免于死亡。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依赖的DNA损伤修复酶。当SM造成DNA损伤后,PARP-1被迅速激活,PARP-1通过消耗NAD+合成大量的聚腺苷二磷酸核糖(poly(ADP-ribose),p ADPr),而p ADPr会共价结合于PARP-1本身或其他DNA损伤修复相关的核蛋白,从而介导DNA损伤修复。然而,当PARP-1过度激活时则会大量消耗细胞内NAD+,造成能量耗竭甚至细胞死亡。提示PARP-1的激活在SM损伤中有十分重要的作用。近年来研究发现,PARP-1抑制剂能够一定程度上的减轻SM造成的病理损伤,表明其在SM损伤中有一定的治疗作用。美军研究表明PARP-1抑制剂能够减轻SM造成的小鼠皮肤病理损伤50%以上,提示PARP-1抑制剂有望用于防治SM中毒。但也有研究表明,虽然PARP-1抑制剂能够避免SM损伤造成的NAD+耗竭,但是对细胞存活并没有明显的保护作用。而且有研究表明,PARP-1抑制剂能够减慢SM损伤后DNA的损伤修复速度。因此PARP-1抑制剂抗SM损伤的药效以及PARP-1在SM损伤中的作用机制并不明确,有待进一步研究和确证。课题组首先合成了美军正在研究并可能用于防治SM中毒的新型PARP-1抑制剂;另外,目前在肿瘤治疗的研究中,出现了新的一批活性及选择性更强的PARP-1抑制剂,这些新的药物抗SM损伤的作用效果值得期待。接下来我们对以上化合物进行了体外分子水平的PARP-1抑制活性筛选,然后选择其中活性较强的化合物在细胞水平及动物水平进行了系统的药效学评价,并对其作用机制进行了探讨。一、PARP-1抑制剂的活性筛选及其抗SM损伤的活性评价首先对化学合成获得的BPUBA、S001、S002、S003等85个化合物进行了体外分子水平的PARP-1抑制活性筛选,进而选择其中活性较强的化合物在细胞水平及动物水平进行了其抗SM损伤活性的评价。1.体外筛选PARP-1抑制剂的活性Trevigen's Homogeneous PARP Inhibition Assay是一个利用荧光的高灵敏体外筛选PARP-1抑制剂的系统,本部分利用此试剂盒筛选化合物对PARP-1的抑制活性。结果显示,S001和S003及其类似物的PARP-1抑制活性较高,而BPUBA、S002及其类似物对PARP-1的抑制活性较低,提示后续研究可重点开展活性较高的S001和S003及其类似物抗SM皮肤损伤的药效学试验。2.体外细胞水平的药效评价体外筛选结果表明,PARP-1抑制剂S001、S003及其类似物对PARP-1有较强的抑制活性,因此后续研究应用SM损伤的永生化人表皮角化形成细胞(Ha Ca T)模型,对这两个化合物及其类似物对SM损伤细胞的保护作用进行了体外药效学评价。应用1000μM SM染毒6h和24h后,Ha Ca T细胞活力均显著性降低,且随着染毒时间增加,细胞活力降低更加明显。S001、S003及其类似物干预后,在染毒后6h,能明显增加细胞活力;而在染毒后24h,S001、S003等化合物虽然仍然能够增加SM染毒组的细胞活力,但是这种作用已逐渐降低。结果表明,以上化合物能够显著减轻SM导致的细胞死亡,且在染毒后6h时的保护作用明显优于24h。3.整体动物水平的药效评价应用0.64mg/ear SM染毒,首先建立了小鼠耳廓SM皮肤损伤模型,继而应用此模型对PARP-1抑制剂进行了整体动物水平的药效评价。结果发现,0.64mg/ear SM染毒后小鼠耳廓水肿程度显著性增加,PARP-1抑制剂S003腹腔注射能够显著性降低0.64mg/ear SM染毒造成的小鼠耳廓水肿,但是给药方式改为口服或涂抹给药时,对0.64mg/ear SM染毒造成的小鼠耳廓水肿则没有明显的减轻作用。结果表明,S003给药方式为腹腔注射时效果较好,但是给药方式改为口服及涂抹时药效不明显。此外,我们应用SM染毒建立了无毛豚鼠SM皮肤染毒模型,并观察了PARP-1抑制剂S003的药效。结果发现,SM可以使皮肤红肿和皮肤血流显著性增加,腹腔注射给予PARP-1抑制剂S003后能显著性降低SM造成的皮肤红肿和皮肤血流增加。二、PARP-1抑制剂在SM损伤中的作用及机制研究综合体外活性筛选和体内外的药效评价结果,确定了药效最好的PARP-1抑制剂S003,继而在Ha Ca T细胞染毒模型上对其抗SM损伤的作用及其机理进行研究,并探讨了PARP-1抑制剂在SM损伤防治中的应用价值。1.PARP-1抑制剂S003对SM所致PARP-1激活的抑制作用应用荧光的高灵敏体外筛选PARP-1抑制剂的试剂盒,检测了活性最强的PARP-1抑制剂S003及经典的PARP-1抑制剂3-AB对PARP-1的IC50值,评价了其对PARP-1的抑制作用。结果表明,PARP-1抑制剂S003(IC50=60.22n M)抑制PARP-1的能力比3-AB(IC50=10.86μM)强180倍以上。采用免疫荧光法及Western Blot方法,于100μM及1000μM SM染毒后立即给予S003,观察SM染毒Ha Ca T细胞损伤模型PARP-1的活化及S003对PARP-1活化的抑制作用。结果显示,100μM和1000μM SM染毒6h后,Ha Ca T细胞内PARP-1活化产物p ADPr的表达均明显增加,1000μM SM诱导PARP-1的活化程度明显高于100μM SM。SM染毒后立即应用S003可显著降低Ha Ca T细胞中p ADPr的表达,在1000μM SM染毒时效果最为明显。结果提示,SM损伤可导致PARP-1活化,给予S003可以显著抑制PARP-1的激活,提示S003是一个有效的PARP-1抑制剂。2.PARP-1抑制剂S003对SM所致Ha Ca T细胞及小鼠耳廓皮肤损伤的作用在Ha Ca T细胞SM染毒模型上,观察了SM不同染毒浓度(100μM及1000μM)染毒6h和24h后S003对细胞活力的作用。结果显示100μM及1000μM SM可以使细胞活力显著性降低。在染毒后6 h,给予S003显著增加了1000μM SM染毒组的细胞活力,而对100μM SM染毒组没有观察到药效。然而在染毒后24h,不论在100μM SM还是1000μM SM染毒条件下,均没有观察到S003保护细胞活力的作用。在小鼠耳廓SM染毒模型上,观察了SM不同染毒浓度(0.16mg/ear,0.64mg/ear)染毒24h后,S003对小鼠相对耳肿程度(REW)及表皮坏死(EN)的作用。结果表明,高浓度SM染毒组(0.64mg/ear)的评分(REW 204.83,EN 3.9)显著性高于低浓度SM染毒组(0.16mg/ear)的评分(REW 154.67,EN 2.2)。给予PARP-1抑制剂S003后,显著性降低了高浓度SM染毒组的REW评分(26%)及EN评分(40%),而对低浓度SM染毒组的评分没有显著性影响。采用HE染色方法观察SM对小鼠耳廓皮肤的损害。结果显示,暴露于0.16mg/ear及0.64mg/ear SM后24h均会造成小鼠耳廓皮肤中度到重度的病理学改变,主要表现为真皮炎症细胞浸润、网状变性及表皮基底细胞坏死,伴随高嗜酸性粒细胞的细胞质及细胞核固缩。给予S003 24h后对0.64mg/ear SM造成的细胞核固缩有明显的保护作用,而对0.16mg/ear SM造成的损伤没有明显作用。上述结果提示,PARP-1抑制剂S003在Ha Ca T细胞及小鼠耳廓模型上对SM损伤有一定保护作用。3.PARP-1抑制剂S003对SM所致NAD+/ATP耗竭及凋亡坏死的影响国际上已有体内外的实验证明,SM染毒可以造成PARP-1的过度激活及NAD+含量的降低。我们对本研究中应用的Ha Ca T细胞染毒模型上SM对NAD+/ATP的影响进行了验证并考察了S003的药效。结果提示,SM染毒会浓度依赖性地降低细胞内NAD+/ATP含量,而染毒后立即给予S003后对SM造成的NAD+/ATP含量降低有保护作用。此外,SM介导的PARP-1的活化可能会造成细胞坏死或凋亡。因此,通过Annexin V/PI双染实验观察了SM对细胞凋亡和坏死的影响并评价S003的作用。结果表明,SM能造成明显的细胞凋亡和坏死,给予S003可显著降低凋亡和坏死的细胞数目。在接下来的实验中,我们继续研究了S003对凋亡执行蛋白Caspase 3活力的影响,以及S003对重要的凋亡信号也就是Caspase 3切割PARP-1的产物c-PARP表达的影响。结果显示,染毒后6h,随着SM浓度的增加,Caspase 3的活性及c-PARP的表达也显著增加,而染毒后立即给予S003会显著性降低高浓度SM(1000μM SM)染毒造成Caspase 3的激活及c-PARP的表达,而对低浓度SM染毒(100μM SM)造成的Caspase 3的激活及c-PARP的表达没有显著性降低作用;染毒后24h,Caspase 3的活性及c-PARP的表达亦显著性增加,S003能够显著性降低100μM及1000μM SM造成Caspase 3激活,而对c-PARP没有明显的作用。上述结果提示,PARP-1抑制剂S003对高浓度SM染毒细胞具有保护作用,主要原因可能在于减轻了SM染毒造成的严重的NAD+/ATP耗竭及凋亡坏死。S003对低浓度SM所致的细胞损伤没有保护作用,原因可能在于低浓度SM染毒对细胞损伤较轻,NAD+/ATP消耗及凋亡坏死程度较轻。4.PARP-1抑制剂S003对SM所致DNA损伤的影响当DNA发生断裂,DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)的敏感标志物H2AX会在其Ser139位形成磷酸化,H2AX磷酸化的程度与DNA损伤程度密切相关。我们应用流式细胞仪检测Ha Ca T细胞中H2AX在Ser139位的磷酸化程度,研究SM对DNA损伤的影响及S003的作用。结果表明,染毒后6h和24h SM会显著性增加H2AX的磷酸化。而S003在染毒后6h对H2AX的磷酸化没有明显作用,在染毒后24h进一步增加了SM造成的H2AX磷酸化。这一结果表明PARP-1抑制剂S003可增加SM所致的DNA断裂。三、PARP-1敲降对SM损伤后Ha Ca T细胞的影响采用RNA干扰的方法,敲降Ha Ca T细胞中的PARP-1,深入研究PARP-1在SM损伤中的作用,具体结果如下。1.PARP-1敲降效率的确定及对SM损伤后Ha Ca T细胞活力的影响通过检测RNA干扰后,Ha Ca T细胞中PARP-1 m RNA转录水平及蛋白含量,确定PARP-1在Ha Ca T细胞上的敲降效率。结果表明,PARP-1敲降效率较高,能够进行后续实验。通过检测PARP-1敲降对SM染毒后Ha Ca T细胞活力的影响,研究PARP-1敲降对SM所致细胞毒性的作用。结果表明,PARP-1敲降能够增加细胞活力,减轻SM所致的细胞毒性。2.PARP-1敲降对SM损伤后Ha Ca T细胞凋亡通路的影响通过检测内源性凋亡途径的信号p-JNK、p-p53、Caspase 9、外源性凋亡途径的信号Caspase 8、凋亡蛋白c-PARP的生成和Caspase 3的激活,研究SM染毒后细胞凋亡情况及PARP-1敲降对SM损伤后Ha Ca T细胞凋亡通路的影响。结果表明,PARP-1敲降能够降低SM染毒后Ha Ca T细胞的凋亡,可能是通过降低内源性和外源性凋亡途径信号及凋亡蛋白的激活来发挥作用。3.PARP-1敲降对SM损伤后Ha Ca T细胞Akt/m TOR通路的影响PARP-1可通过影响自噬抑制因子m TOR来参与自噬调节。为了研究SM染毒后是否对Akt/m TOR通路有影响以及PARP-1如何参与到这个过程中,我们在PARP-1敲降及对照的Ha Ca T细胞上检测了Akt及m TOR的磷酸化。提示PARP-1下调可能通过Akt/m TOR通路的重新激活来抑制自噬。上述结果提示PARP-1敲降能显著性的增加SM染毒后Ha Ca T细胞的细胞活力,降低p-JNK、p-p53、Caspase 9、Caspase 8、c-PARP、Caspase 3的激活和Annexin V的染色,进一步证明了降低PARP-1可以通过下调多个凋亡通路的检查点来抑制SM造成的凋亡。另外,PARP-1敲降还能够逆转SM染毒导致的Akt/m TOR通路的抑制,从而可能通过Akt/m TOR的激活来抑制自噬。通过以上研究,本论文主要得出以下结论:1.S003是一种强效的PARP-1抑制剂,其在体外对PARP-1的抑制活性是经典的PARP-1抑制剂3-AB的180倍。2.PARP-1抑制剂S003对SM染毒细胞模型和动物模型均有明显的保护作用。S003对高浓度SM染毒造成的Ha Ca T细胞活力降低有明显的保护作用;S003对高浓度SM造成的小鼠耳廓水肿及病理改变有明显改善作用,对高浓度SM造成的无毛豚鼠皮肤红肿和皮肤血流增加有明显的降低作用。3.PARP-1抑制剂S003抗SM损伤的作用主要可能在于改善SM损伤造成的NAD+/ATP耗竭及降低凋亡和坏死。4.PARP-1敲降可减轻SM损伤,而调节细胞凋亡及自噬相关通路可能是其发挥保护作用的重要途径。5.PARP-1抑制剂S003可增加SM所致的DNA断裂。6.通过进一步研究,S003有望发展为防治SM中毒的新型药物。总之,本研究首先经过体内外药效学评价,筛选出了活性最好的强效PARP-1抑制剂S003,进而采用PARP-1抑制剂S003给药以及PARP-1敲降的方法,对PARP-1抑制剂抗SM损伤的药效及作用机理进行了研究。结果提示,PARP-1抑制剂对高浓度SM小鼠耳廓染毒模型,无毛豚鼠皮肤染毒模型及Ha Ca T细胞模型均有明显的保护作用。下调PARP-1抗SM损伤的作用机理主要为减轻SM损伤造成的NAD+/ATP耗竭,降低细胞凋亡坏死及自噬。然而,PARP-1抑制剂S003可增加SM所致的DNA断裂,提示在应用PARP-1抑制剂治疗SM损伤时应考虑到其对DNA的毒性。此外,目前国际上认为PARP-1抑制剂抗SM损伤的作用机理主要为阻止SM导致的能量耗竭及细胞坏死。而我们的研究结果表明,PARP-1在SM损伤造成的凋亡及自噬中也具有十分重要的作用,这也为PARP-1抑制剂抗SM损伤的作用机理研究提供了新的线索。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
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本文编号：
2412933
