LXR激动剂促进大鼠骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化

发布时间：2019-01-29 21:33

【摘要】：目的:观察肝X受体(Liver X receptors,LXR)激动剂对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)向多巴胺能(dopaminergic,DA)神经元分化的影响,并初步探讨其机制。方法:1.采用全骨髓细胞贴壁法分离、纯化和培养大鼠BMSCs。使用生长良好的第3代大鼠BMSCs进行成脂和成骨诱导分化,鉴定BMSCs多向分化潜能;流式细胞术检测BMSCs表面标记物CD90、CD44、CD45、CD29和CD11b的表达。2.将大鼠BMSCs分为对照组、LXR激动剂组(LXR组)、生长因子组(growth factors,GF组)和生长因子+LXR激动剂组(GF+LXR组)。其中,LXR+GF组在GF的基础作用上,考察LXR激动剂的时间依赖性和浓度依赖性:(1)确定LXR激动剂的加入时间点:在预先给予GF下,不同时间点加入0.5μM LXR激动剂:GF与LXR激动剂同时加入(Day0)、GF作用3天后加入LXR激动剂(Day3)、GF作用6天后加入LXR激动剂(Day6)和GF作用9天后加入LXR激动剂(Day9),采用细胞免疫荧光法测定Tuj1和TH的表达;(2)确定GF联合LXR激动剂的最佳诱导时程:在(1)确定的基础上,LXR+GF培养不同时间,分别为3天、6天、9天和12天,采用细胞免疫荧光法测定Tuj1和TH的表达;(3)确定LXR激动剂的最佳浓度:在(1)和(2)确定的基础上,分别加入0.125、0.25、0.5、1、2μM LXR激动剂,采用细胞免疫荧光法测定TH的表达;采用细胞免疫荧光法测定Nestin、Neun、Tuj1和TH的表达,CCK-8法检测各组细胞生长速率。3.将大鼠BMSCs分为对照组、GF组和GF+LXR(0.5μM)同时加入并诱导作用6天组,采用细胞免疫荧光法测定LXRα和LXRβ的蛋白表达,采用定量PCR测定LXRα、LXRβ、ABCA1、TH、DAT、Nurr1、Pitx3、En1和Lmx1b的m RNA表达。结果:1.全骨髓贴壁法分离、纯化和培养的大鼠BMSCs为长梭形,核大,核仁清晰可见,呈漩涡状生长。该细胞具有向成脂、成骨分化的潜能;流式细胞检测发现,表面标记物CD29、CD90、CD44呈阳性表达,CD45、CD11b呈阴性表达。2.对照组和LXR组中,细胞呈典型的BMSCs形态,即长梭形;细胞生长速率随培养时间延长逐渐增加,两组无显著差异;LXR组细胞几乎无Nestin、Neun、Tuj1和TH表达,这表明单独使用LXR激动剂处理BMSCs对其增殖和分化没有明显影响。在GF加入的基础上,Tuj1和TH的表达在LXR激动剂与GF同时加入(Day0)最显著,并随着LXR激动剂加入时间的延迟,Tuj1和TH的表达逐渐减少。LXR激动剂与GF同时加入,Tuj1和TH的表达随LXR激动剂与GF诱导时程增加而增加,6天达到峰值,细胞呈典型的神经元形态,同时细胞均有Nestin和Neun表达;6天后,Tuj1和TH的表达降低。不同浓度的LXR激动剂联合GF同时加入并诱导作用6天,细胞均呈现出胞体聚拢并有细长突起,TH表达显著;随LXR激动剂浓度增加,TH表达先升高后降低,在LXR激动剂的浓度为0.5μM时,TH的表达达峰值。与对照组相比,GF作用12天,其诱导分化率为62.61±2.334%。与单纯GF处理相比,LXR(0.5μM)+GF同时加入并诱导6天,其分化率为87.42±7.573%。3.与对照组相比,GF组LXRα、ABCA1、TH、DAT、Nurr1和Pitx3 m RNA表达显著升高,En1和Lmx1b m RNA表达显著降低。与GF组相比,LXR+GF组LXRα和β蛋白以及m RNA表达显著升高,ABCA1、TH、DAT、Nurr1和Pitx3的m RNA表达显著升高,En1和Lmx1b m RNA表达显著降低。结论:1.单独使用LXR激动剂不能显著诱导大鼠BMSCs向DA神经元分化。2.LXR激活可提高大鼠BMSCs向DA神经元分化的效率并缩短诱导时间;LXR激动剂与GF联合诱导的最佳方案为LXR(0.5μM)与GF同时加入并诱导作用6天。3.LXR激动剂促进大鼠BMSCs向DA神经元分化的机制可能涉及激动LXR,调节ABCA1和DA神经元发育相关基因的表达。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

【参考文献】