抗乙酰肝素酶单抗的制备及其与紫杉醇联用对乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力的影响

发布时间：2019-02-13 20:51

【摘要】：目的：乙酰肝素酶（heparanase, HPA）作为唯一一种内源性D-葡萄糖醛酸内切酶，能够降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG)。而HSPG是糖胺聚糖的主要组成部分，在肿瘤扩散和转移过程中扮演着不可或缺的角色。HPA通过降解HSPG的硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）侧链而破坏了组织的完整性，并且促进多种活性分子（生长因子、细胞因子等）的释放，所以对肿瘤的浸润、转移及肿瘤血管的生成都有着重要的作用。本研究的目的在于筛选获得特异性较好的抗HPA单克隆抗体，通过初步体外实验研究抗HPA单抗与紫杉醇联用后对乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力的影响。为研制抗肿瘤转移的药物奠定基础，为研究HPA在肿瘤发生发展中的作用机制以及在肿瘤诊断、治疗、预后中的作用提供材料。选择紫杉醇与抗HPA单抗联用，为乳腺癌在临床治疗中奠定理论基础。方法：本实验用已制备的原核表达HPA50kDa蛋白质为抗原，免疫BALB/c小鼠，用杂交瘤细胞融合技术制备抗HPA单克隆抗体，经捕获型ELISA和试纸条测定小鼠抗体亚类，用PEG6000沉淀、分子筛层析对抗体进行纯化，通过间接ELISA和Western Blot进行单克隆抗体特异性鉴定。通过MTT法、流式细胞术-PI单染、细胞划痕试验、Transwell法探讨紫杉醇与抗HPA单克隆抗体联用后对乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力的影响。结果：（1）原核表达HPA50kDa蛋白质在经过透析、浓缩及蛋白浓度测定后，作为抗原免疫5只BALB/c小鼠，，三次免疫后通过间接ELISA检测，3号和4号小鼠效价较高，达到了达到1:64000以上，选用4号小鼠进行实验。采用细胞融合技术，取4号小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞用PEG融合，通过HAT筛选杂交瘤细胞，融合率约为90%，阳性率约为82%。亚克隆采用的是有限稀释法，筛选出14株能够稳定分泌表达目的抗体的—抗HPA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为2A4-2、2B9-2、2C3-2、2C8-2、2F6-2、2G11-2、3B8-2、4B11-3、4D4-2、4E5-2、4G11-3、5C7-2、5F2-2、6D3-2。经捕获型ELISA和试纸条测定后，分泌抗体亚类均为IgM。选择7株细胞（2B9-2、2C3-2、2C8-2、3B8-2、4B11-2、4D4-2、5C7-2）注射小鼠腹腔，制备腹水获得单抗。通过间接ELISA和Western Blot鉴定单克隆抗体特异性，得到特异性较好的3种抗体2C3-2、3B8-2、4D4-2。在纯化过程中，先采用PEG6000沉淀对腹水进行初步纯化，初步纯化后抗体纯度约为80%，再通过分子筛柱进一步纯化，浓缩后蛋白含量为0.116mg/ml。（2）选用纯化后的抗HPA单抗3B8-2，干预乳腺癌细胞（MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞）后发现细胞形态发生了明显的改变。单用抗HPA单抗时，对乳腺癌细胞（MCF-7细胞、MCF-7/F5细胞、MDA-MB-231细胞、SK-BR-3细胞）抑制作用最大的是MCF-7/F5细胞，在抗HPA单抗浓度为5μg/ml时的细胞抑制率为22.37%；紫杉醇单用时，对于乳腺癌细胞的抑制作用呈浓度依赖性；将紫杉醇与抗HPA单抗联用后，对于4种乳腺癌细胞的抑制作用都有明显的增强。对于细胞周期，两药联用后MCF-7细胞、MCF-7/F5细胞、MDA-MB-231细胞分别出现了15%、33.7%、53.6%的细胞凋亡。在乳腺癌细胞MCF-7/F5的侵袭能力方面，抗HPA单抗干预组的穿透率为75%，将紫杉醇与抗HPA单抗联用后，穿透率从紫杉醇干预时30%的穿透率降低至20%。与单用抗HPA单抗相比较，具有极显著差异（P0.01）；与单用紫杉醇相比较，具有显著差异（P0.05）。结论：（1）本实验筛选出能够稳定分泌高特异性的抗HPA单抗，并且制备出纯度达90%以上的抗HPA单抗样品。（2）抗HPA单抗与紫杉醇联用后，对细胞增殖、细胞侵袭的抑制作用与两药单用时的作用明显增强，抗HPA单克隆抗体可增强紫杉醇抑制肿瘤细胞增殖和侵袭的能力。
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【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R943;R96

【参考文献】