抗菌肽CPF-C1及其类似物对临床耐药细菌的抗菌活性和机制研究

发布时间：2019-02-28 18:31

【摘要】：细菌耐药是一个日益严重的公共卫生问题,已被越来越多的政府和相关部门所关注,并影响着现代医学的成就。然而至今尚未开发出足够的药物解决这一问题,因此迫切需要研发新的抗菌药物用于控制难治性感染。革兰阳性的金黄色葡萄球菌和革兰阴性的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌为目前导致院内感染的最常见细菌。抗菌肽为一类双亲性阳离子多肽,是宿主先天防御至关重要的组成部分,具有广谱的抗微生物活性。绝大多数抗菌肽通过独特的胞膜损伤机制来杀死细菌,这一作用方式不同于目前临床使用的抗生素,病原菌很难通过改变细胞膜成分而产生对抗菌肽的耐药性,因而抗菌肽在治疗耐药菌引起的感染方面显示出良好的应用前景,近年受到广泛关注,成为新型抗菌药物研发的热点。CPF-C1(GFGSLLGKALRLGANVL.NH2)是从非洲爪蛙皮肤分泌物中分离出的具有抗菌活性的十七肽,是一条带有正电荷的阳离子多肽,预测二级结构为α-螺旋,对常见革兰阴性细菌和革兰阳性金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,溶血活性较低,其它理化性质及作用机制尚未见报道。本课题选择这一新发现报道的抗菌肽CPF-C1为研究对象,首先检测了其对上述临床常见细菌耐药株的抗菌活性。结果显示,CPF-C1不仅对临床常见细菌的标准株具有抗菌活性,对相应的耐药株也具有较高的抗菌活性,与传统抗生素形成了鲜明对比。研究作用机制表明,CPF-C1通过破坏细菌的细胞内外膜,使细胞内容物外漏而杀死细菌。因此,我们认为CPF-C1可以作为理想的模板进行抗菌药物的研发。在进一步研究CPF-C1的生物学活性时,我们发现CPF-C1的稳定性很差,低浓度(0.002μg/ml)的胰蛋白酶作用1小时后就可以使其丧失抗菌活性,在血清中也极易被降解,4小时的残留量仅为16.71%。因此接下来的工作,我们在保证或提高抗菌活性的基础上,以提高稳定性为目的,对其进行改造。我们在多肽序列中通过引入碱性氨基酸赖氨酸增加抗菌肽的正电荷数;通过引入疏水性氨基酸色氨酸提高多肽的疏水性并增强对细胞膜的作用;通过引入D-型氨基酸使多肽不易被蛋白酶降解,提高其稳定性。化学合成出一系列类似物后,通过对类似物抗菌活性、稳定性和溶血活性的检测,最终筛选出CPF-8具有最优的药用潜质:抗菌活性高于母肽(最小抑菌浓度为8 μg/ml);稳定性大幅提升,在胰蛋白浓度为200 μg/ml,作用6小时后仍具抗菌活性,在血清中24小时的残留量为72.66%;溶血活性也明显降低,在实验检测的最大浓度时(512 μg/ml)对红细胞也无溶血作用。类似物CPF-8高效低毒稳定性好,可以作为候选化合物用于进一步深入的研究。课题接着对抗菌活性较高或生物学活性特点鲜明的部分类似物进行了生物膜形成抑制实验和已形成生物膜的破坏实验。我们发现,实验类似物与CPF-C1不同,在低于最小抑菌浓度时也能够不同程度地抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成,部分类似物高浓度能够破坏已形成的生物膜,具有了新的生物学活性。课题最后对这些类似物进行了作用机制的初步研究,结果显示,一些类似物与CPF-C1不同,不仅作用于细胞膜,还能和细胞内DNA结合,通过双靶点作用发挥杀菌活性。本课题通过对稳定性低的天然抗菌肽CPF-C1进行化学改造,成功获得了稳定性显著提高,并且抗菌活性增强、溶血活性降低的类似物,可作为候选化合物进行后续研究;通过类似物构效关系的研究,为今后抗菌肽的改造提供了研究基础和理论依据;通过对CPF-C1及其类似物抗菌机制的研究,为这一类抗菌肽的作用机制理论提供了有益补充。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R978

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本文编号：2432053